Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Этот протокол описывает связывание рецептора шаблоны для ангиотензина II (Ang II) в головном мозге крысы с использованием радиолиганда, специфичного для рецепторов Ang II для выполнения рецептора авторадиографического отображение.
Тканевые образцы собирают и хранят при -80 ° С. Криостат используется для коронковой секции ткани (мозг) и оттепели монтажа секций на заряженных горками. Срезы ткани слайд монтажа инкубируют в 125 I-SI-Ang II к радиоактивной рецепторов Ang II. Прилегающие слайды разделены на две группы: 'неспецифического связывания' (NSP) в присутствии насыщающей концентрации рецепторов не-меченного Ang II, или АТ 1 рецепторов подтипа Ang II (AT 1 R) селективный антагонист рецептора АТ II и 'не общего связывания' без AT 1 антагониста R. Концентрация насыщающего АТ 2 подтипа рецептора Ang II (АТ 2 R) антагонист (PD123319, 10 мкМ) также присутствует в incubatiна буфер для ограничения 125 I-SI-Ang II связывание с AT 1 R подтипа. В течение 30 мин предварительной инкубации при ~ 22 ° C, NSP горок подвергаются 10 мкМ PD123319 и лозартана, в то время как 'общего связывания' горок подвергаются 10 мкМ PD123319. Слайды затем инкубируют с 125 I-SI-Ang II в присутствии PD123319 для общего уровня связывания », и PD123319 и лозартан для NSP в буфере для анализа, а затем несколько« стирок »в буфере, и воду , чтобы удалить соль и не- специфически связанного радиолиганда. Слайды сушат с использованием выдувного сушилки, затем подвергали авторадиографии пленки с использованием специализированной пленки и кассеты. Фильм разработан и изображения сканируются в компьютер для визуального и количественного денситометрии с использованием собственной системы обработки изображений и электронных таблиц. Дополнительный набор слайдов тионин окрашенных гистологических сравнений.
Преимущество использования авторадиографии рецептора является возможность визуализироватьАнг рецепторов II в месте, в пределах участка тканевого образца, а также анатомически определить область ткани, сравнивая его с соседней гистологического справочном разделе.
Сердечно – сосудистые заболевания по- прежнему является ведущей причиной смерти и инвалидности в Соединенных Штатах, в результате чего более 30% смертельных случаев в США в 2011 году 1. Самые последние статистические данные из Американской ассоциации сердца показывают , что более чем один человек в трех имеет один или более тип сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые исследования продолжают добиваться успехов в отношении понимания этой болезни, но, как поколения начинают стареть крайне важно продолжать эти усилия. Система ренин-ангиотензин (RAS) , играет центральную роль в регуляции сердечно – сосудистой системы , в первую очередь путем продвижения атеросклероза, воспаления, системную вазоконстрикцию и активацию симпатической нервной системы (рис 1) 2-8.
РАН является гормональная система, которая активируется, когда юкстагломерулярной клетки почки выделяют ренин в кровоток в ответ на снижение артериального давления, увеличение sympathetic стимуляция или снижение потока натрия с помощью макулы Densa. Ренин усваивает ангиотензиноген (синтезированного в печени) с образованием ангиотензина I (Ang I). Анг я затем метаболизируется ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), в ectoenzyme на просвете стороне клеток эндотелия сосудов, в первую очередь в легких и почках, с образованием ангиотензина II (анг II), главный эффекторный пептид РАН. Анг II способен активировать два подтипа рецепторов; рецептор типа 1 (AT 1 R) и рецептор типа 2 (AT 2 R), и которые регулируют сердечно – сосудистой системы, поддержания жидкости и электролитов гомеостаз и в настоящее время считаются влияют на когнитивные функции и нейродегенеративные заболевания процессов 8,9. Местный, специфичная для головного мозга РАН сообщается самостоятельно синтезировать Ang II. В головном мозге, белок – предшественник ангиотензин синтезируется в астроглию 10 обращенных к Ang I с помощью ренин-подобный фермент 3, возможно , проренина , связанный с рецептором проренина11, а затем превращают в Ang II ангиотензин-превращающего фермента , который в большом количестве экспрессируется на внеклеточной поверхности нейронов в головном мозге 12. Это intrabrain генерируется Ang II является агонистом для мозга АТ 1 и АТ 2 рецепторов, которые изолированы от передающейся через кровь Ang II.
В то время как AT 1 R играет важную физиологическую роль, она лучше известна своими патофизиологические эффекты по всему телу, в первую очередь влияет на сердечно – сосудистую систему и почки (рисунок 2). Когда Ang II связывается с AT 1 R, он вызывает вазоконстрикцию; повышение устойчивости к кровотока и повышение кровяного давления. Он также стимулирует синтез и секрецию альдостерона и вазопрессина, что приводит к увеличению задержки натрия и воды. Эти эффекты могут также вызвать ишемического повреждения головного мозга и когнитивных нарушений и связана с болезнью Паркинсона, болезнь Альцгеймера, и diabeTES, а также будучи недавно идентифицированы влиять на обучение и память 13-15. Существует петля обратной связи в РАН в том , что AT 1 R на юкстагломерулярных клеток в почках ингибирует секрецию ренина. Интересно отметить , что AT 2 R , как правило против регулирует действие AT 1 R, вызывая вазодилатацию, невритов, регенерацию аксонов, анти-пролиферацию и cerebroprotection среди многих других 16-20. AT 2 R также была определена в качестве мишени для анти-гипертензии и в последнее время , противораковых препаратов 21. Определение локализации и плотности рецепторов Ang II в пределах различных тканей и как они подвергаются воздействию различных методов лечения и болезненных состояний с использованием количественного денситометрическую авторадиографии рецептора поможет раскрыть роль РАН играет в конкретных заболеваний.
Рецептор радиоавтография был использован на протяжении более 30 лет в качестве эффективного метода для индикации присутствия ангиотензина II рецепторы и другие компоненты РАН в головном мозге и других тканях крысы, мыши, морской свинки, собаки и человека при различных экспериментальных условиях 22-34. Важность определения местоположения рецепторов Ang II в мозге является то , что можно применить функциональную нейроанатомии к действиям Ang II в головном мозге, например, присутствие AT 1 R в паравентрикулярной ядре гипоталамуса (PVN) предлагает функцию Ang II в головном мозге, чтобы стимулировать вазопрессин, окситоцин или рилизинг гормон (CRH) релиз, или активацию симпатической нервной системы. Таким образом, препараты , которые блокируют AT 1 R может уменьшить некоторые из этих PVN-опосредованных эффектов , связанных с за деятельностью мозга РАН. Работа в прогрессе предполагает , что применение антагонистов AT 1 R может уменьшить посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) -индуцированное высвобождение КРГ и смягчить симптомы ПТСР (Hurt и др., Который был представлен для публикации). PVN, subfornicalорган (SFO), и миндалина известны для регуляции гомеостаза, аппетит / жажда, сон, память, эмоциональные реакции, и являются целевыми направлениями этого демонстрационного исследования. Эти регионы были исследованы путем сбора Коронарные срезы головного мозга на предметные стекла микроскопа, и обрабатывать участки с специфическими ингибиторами наряду со специфическим радиолиганда для рецепторов Ang II. В этом исследовании все материалы и реагенты и способы их поставщиков перечислены, Йод-125 был использован для радиоактивной антагонист Ang II рецептора, саркозина 1, изолейцин 8 Ang II (SI Ang II), который затем очищали , как моно 125 I -SI АТ II с использованием методов ВЭЖХ , как описано ранее 35. Использование этой высокой удельной активности радиоактивного лиганда позволяет визуализировать зоны с низкой, средней и высокой плотности рецепторов после воздействия на радиоактивно меченных участков с рентгеновской пленкой. Путем калибровки пленку со стандартами мозга пасты, содержащей известное количество йода-125, конкретные суммыангиотензина II связывания рецепторов в области может быть определена количественно. В экспериментальных исследованиях, рецептор Ang II связывание в мозге испытуемых можно сравнить с, что в мозге контрольных субъектов. Это может указать, является ли изменены действия Ang II в ответ на генетическое состояние, фенотипические аномалии, болезненного состояния или медикаментозного лечения. Это знание может быть применен к разработке методов лечения для лечения заболеваний, связанных с нарушением регуляции РАН. Альтернативные методы , которые идентифицируют рецептор сайты связывания, но с уменьшенной анатомической разрешением, являются обязательными для анализов , которые используют мембранные препараты тканей , полученных из гомогенатов тканей, которые инкубируемых с меченым лигандом в диапазоне концентраций с целью оценки связывания радиолиганда сродством как константа диссоциации (K D ) и максимальная связывающая способность (в макс) интересующей ткани.
Протокол, описанный здесь, может быть разбита на 5 основных сотрудничестваmponents: Готовимся Tissue Разделы для рецептора авторадиографии; Рецептор Авторадиография; Фильм экспозиции и развития; гистологии; и Денситометрический анализ изображений.
Описанный протокол идентифицирует визуализацию 'Total' и 'неспецифический' связывания радиолиганда в смежных участках корональных секций грызуна мозга ранее заготовленной и хранили при -80 ° С, и может быть легко применимы к практически в каждой ткани, имеет анатомически решен по…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH Grant HL-113905
500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
Photo flo | Kodak | 1464502 | |
Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
NaCl | Fisher | S271 | |
Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
Permount | Fisher | SP15-100 | |
PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
Thionin | Fisher | T409-25 | |
X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL |