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Neuroscienze

안지오텐신 II 수용체의 현지화 시각화에 대한 수용체자가 방사선 프로토콜

Published: June 07, 2016
doi:
10.3791/53866
, , ,
1Farquhar College of Arts and Sciences,Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Nova Southeastern University, 3School of Medicine,University of Colorado

Summary

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Abstract

이 프로토콜은 중앙 II 수용체 수용체 방사 법적 매핑을 수행하기위한 특정한 방사성 리간드를 사용하여 쥐의 뇌에서 안지오텐신 II (중앙 II)에 대한 수용체 결합 패턴을 설명합니다.

조직 표본 채취 및 -80 ° C에 저장됩니다. 그라 이오 스탯은 coronally 섹션에 조직 (뇌)를 사용하고 충전 슬라이드에 섹션을 장착 해동. 슬라이드에 장착 된 조직 섹션은 중앙 II 수용체를 방사성 표지 125 I-SI-중앙 II에서 배양된다. 인접한 슬라이드 두 가지로 구분된다 : 수용체 포화 비 방사성 중앙 II의 농도 또는 존재하에 (NSP)를 '비특이적 결합을'1 중앙 II 수용체 아형 AT (1 R AT) 선택적 중앙 II 수용체 길항제 , 1 R 길항제 없음으로 '결합되지 합계'. 이 중앙 II 수용체 아형 AT (2 AT R)의 포화 농도의 길항제 (PD123319, 10 μM)도 incubati에 존재버퍼에 AT (1) R 하위 유형에 결합하는 125 I-SI-중앙 II를 제한합니다. 22 ° C가, NSP 슬라이드 10 μM PD123319과 로사 르탄에 노출되어 ~에서 30 분 사전 부화 중에 슬라이드 10 μM PD123319에 노출되는 '바인딩 합계'있다. 슬라이드는 '결합 합계'위한 PD123319의 존재하에 125 I-SI 중앙 II와 함께 배양하고, 분석 완충액에 NSP위한 PD123319과 로사 르탄, 여러 '세척'다음 완충액 및 물을 염과의 비를 제거한다 특히 방사성 리간드를 결합. 슬라이드는 전문 필름 카세트를 사용하여 다음자가 방사선 필름에 노출 타격 건조기를 사용하여 건조된다. 필름을 현상하고 이미지 독자적인 영상 시스템 및 스프레드 시트를 사용하여 시각적이고 정량적 농도계위한 컴퓨터로 스캐닝된다. 슬라이드의 추가 설정은 조직 학적 비교를 thionin 염색된다.

수용체자가 방사선을 사용하는 장점은 시각화하는 능력이다중앙 II 티슈 시험편의 단면 내의 시츄 수용체 및 해부학 인접한 조직 학적 기준 단면과 비교하여 조직의 영역을 식별한다.

Introduction

심혈관 질환 2011 년 1 년 미국에서 사망의 30 % 이상을 일으키는 원인이 미국에서 사망과 장애의 주요 원인이되고 있습니다. 미국 심장 협회 (American Heart Association)에서 가장 최근의 통계는 세 개 이상 한 사람이 하나가 나타냅니다 심혈관 질환의 이상 유형입니다. 심장 혈관 연구는이 질병을 이해에 진전을 만들기 위해 계속되지만 세대가 나이가 점점 시작으로 이러한 노력을 계속하는 것이 필수적이다. 레닌 – 안지오텐신 시스템 (RAS)는 주로 (도 1) 2-8 교감 신경계의 동맥 경화, 염증, 전신 혈관 수축 및 활성화를 촉진하여 심혈 관계의 조절에 중요한 역할을한다.

RAS 장치 혈압 감소하는 신장의 방 사구체 세포 응답하여 혈류로 레닌 분비 될 때 활성화되는 호르몬 시스템, sympat 증가hetic 자극, 또는 황반 densa에 의한 나트륨의 흐름을 감소. 레닌 안지오텐신 I (ANG I)을 형성 (간에서 합성) 안 지오 텐시 노겐을 대사. 중앙 I는 안지오텐신 II (ANG II) 상기 RAS의 주요 이펙터 펩타이드를 형성하기 위해, 주로 폐, 신장, 혈관 내피 세포의 내강 측에, 안지오텐신 전환 효소 (ACE)에 의해 ectoenzyme을 대사한다. 중앙 II는 두 개의 수용체 아형을 활성화 할 수있다; (1 AT R) 타입 1 수용체 (2 R AT) 2 형 수용체는 심장 혈관 시스템을 조절하는 모두, 유체 및 전해질 항상성을 유지하고 지금은인지 기능 및 신경 퇴행성 질환에 영향을 미치는 것으로 간주됩니다 8,9을 처리합니다. 로컬, 뇌 특정 RAS는 독립적으로 중앙 II를 합성보고됩니다. 뇌에서, 전구체 단백질 지오 텐시 노겐는 레닌과 같은 ​​효소 I (3) 중앙으로 변환 별아교 세포 (10)에서 합성되고, 아마도 prorenin prorenin 수용체에 결합(11)이어서 풍부 뇌 12 뉴런의 세포 표면에 발현되는 안지오텐신 전환 효소에 의해 중앙 II로 전환. 중앙 II 생성이 intrabrain 1 AT 뇌에 대한 혈액을 매개로 중앙 II 분리되어 2 수용체에 작용 물질이다.

상기 한 R 중요한 생리 학적 역할을하지만, 더 나은 주로 심혈관 및 신장 (도 2)에 영향을 몸 전체의 병태 생리 학적 효과로 알려져있다. 중앙 II는 AT (1) R에 결합하면 혈관 수축의 원인; 혈류에 대한 저항을 증가시키고 혈압을 올리는. 또한, 증가 된 나트륨 및 보수성 선도 및 바소프레신​​ 알도스테론의 합성 및 분비를 촉진한다. 이러한 효과는 허혈성 뇌 손상 및인지 장애를 유발할 수 있으며, 파킨슨 병, 알츠하이머 병에 연결되며, diabeTES, 최근에 발견 된뿐만 아니라 학습과 기억 13-15에 영향을 줄 수 있습니다. 신장의 방 사구체 세포에 1 R AT 점에서 RAS의 피드백 루프는 레닌 분비가 억제됩니다. 흥미롭게도, AT (2) R은 일반적으로 1 R AT, 많은 다른 16 ~ 20 사이에서 혈관 확장, 신경 돌기의 가지, 축삭 재생, 항 증식 및 cerebroprotection의 원인의 조치를 반대 조절한다. 상기 R 2는 항 고혈압 최근에는 항암제 (21) 타겟으로서 확인되었다. 다양한 조직 내에서 중앙 II 수용체의 현지화 및 밀도를 결정하는 방법 그들은 RAS 특정 질병의 역할을 파악하는 데 도움이됩니다 양적 농도계 수용체자가 방사선을 사용하여 다양한 트리트먼트와 질병 상태에 의해 영향을받습니다.

수용체자가 방사선는 안지오텐신 I의 존재를 지시하기위한 효과적인 방법으로서 30 년 이상 사용되어왔다I 수용체와 뇌에서 RAS의 다른 구성 요소와 실험 조건 22-34의 다양한에서 쥐, 마우스, 기니 돼지, 개와 인간의 다른 조직. 뇌에서 중앙 II 수용체 위치의 중요성은 하나의 뇌에서 중앙 II의 작용에 기능적 신경 해부학을 적용 할 수 있다는 것, 예를 들면 시상 하부 (PVN)의 뇌실 핵 AT 한 R의 존재는 중앙의 기능을 제시 뇌 II는 바소프레신​​, 옥시토신 또는 부 신피질 자극 호르몬 방출 호르몬 (CRH) 방출, 또는 교감 신경계의 활성화를 촉진한다. 따라서, AT (1) R을 차단하는 약물은 뇌 RAS의 활동을 통해과 관련이 PVN 매개 효과의 일부를 줄일 수 있습니다. 진행중인 작업은 1 R 길항제 AT의 사용은 CRH의 외상 후 스트레스 장애 (PTSD) – 유도 방출을 감소시키고 PTSD의 증상을 개선 할 수 있음을 시사한다 (상처 등., 게시를 위해 제출). PVN, subfornical기관 (SFO)와 편도체는 항상성, 식욕 / 갈증, 수면, 기억, 감정 반응을 조절하기위한 알려져 있으며,이 시범 연구의 대상 지역이다. 이 영역은 현미경 슬라이드에 뇌의 코로나 섹션을 수집하고, 중앙 II 수용체에 대한 특정 방사성 리간드와 함께 특정 억제제와 섹션을 처리하여 조사 하였다. 본 연구에서 제안 된 벤더와 함께 모든 물질 및 시약 나열 요오드 125는 모노 125 I로 정제 된 중앙 II 수용체 길항제, 사르코 1 이소류신 8 중앙 II (SI 중앙 II)을 방사성 표지하는 데 사용되는 이전 35 설명 된 바와 같이 HPLC 방법을 사용하여 -SI 중앙 II. 이러한 높은 비 활동 방사성 리간드의 사용은 X 선 필름에 방사성 표지 부분의 노출 된 후 낮은 중간 및 높은 수용체 밀도 영역의 가시화를 허용한다. 요오드 (125)는 특정 량의 공지 된 양을 함유하는 뇌 페이스트 표준 필름을 교정함으로써영역에 결합 중앙 II 수용체 정량화 할 수있다. 실험 연구에서, 피험자의 뇌에서 바인딩 중앙 II 수용체 대조군의 뇌에서와 비교 될 수있다. 이것은 중앙 II의 행동이 유전 적 조건, 표현형 이상, 질병 상태 또는 약물 치료에 대한 응답으로 변경할지 여부를 표시 할 수 있습니다. 이 기술은 다음 RAS의 조절 곤란과 연관된 질환을 치료하는 치료제의 개발에 적용 할 수있다. 해부학 적 해상도하지만 사이트를 수용체 결합을 식별하는 대안적인 기술은, 해리 상수 방사성 리간드 결합 친화도를 평가하기위한 농도 범위에 걸쳐 방사성 리간드와 인큐베이션 조직 균질 물로부터 유도 된 조직의 막 제제를 사용하여 검정 (K D를 바인딩 관심의 조직) 및 최대 바인딩 용량 (B 최대).

여기에 설명 된 프로토콜은 5 대 공동으로 세분화 될 수있다mponents : 수용체자가 방사선에 대한 조직 섹션을 준비; 수용체자가 방사선; 필름의 노출 및 개발; 조직학; 및 농도계 이미지 분석.

Protocol

이 연구 수행 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 맞은 노바 사우스 이스턴 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다, 제 8 판 (국립 아카데미 프레스, 워싱턴 DC, 2011 ). 수용체자가 방사선 1. 준비 조직 섹션 희생시 수확 신선한 뇌 조직, 및 알루미늄 호일 대신에 포장 -20 ° C에 냉동 빨리. 20 ° C 냉동 – 정확한 형상을 유지 두개골…

Representative Results

레닌 – 안지오텐신 시스템의 대사 경로의 개요도 2에 설명되어있는도 1 (R 1 R AT 2 AT) 안지오텐신 II 수용체 아형에 직접 포커스에 나타낸다. (3) 디스플레이를 관상 뇌의 이동도 도 4에 도시 된 바와 같이 다음 소정의 125 I-시앙 II 농도를 사용하여 수용체자가 방사선 절차를 통해 실행된?…

Discussion

기술 된 프로토콜은 설치류 뇌 이전에 수거하고 -80 ℃에서 보관의 관상 부의 인접 부에서의 방사성 리간드의 결합을 '전체'및 '비​​특이적'의 시각화를 식별하고, 거의 모든 조직에 용이하게 적용 할 수 있다는 해부학 적 수용체 또는 방사성 리간드 결합 부위의 차이 금액을 표시 하부 구조를 해결했다. 프로토콜에서 설명하는 절차는 간단하고 정확하게 분석 결과를 해석 중요하다. …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH Grant HL-113905

Materials

500ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24mm x 60mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24x30cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8×11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep / OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL
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Riferimenti

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Linares, A., Couling, L. E., Carrera, E. J., Speth, R. C. Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors. J. Vis. Exp. (112), e53866, doi:10.3791/53866 (2016).
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