Receptor Protocole autoradiographie pour la visualisation Localisée de l'angiotensine II Receptors
Summary
Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Abstract
Ce protocole décrit les profils de liaison aux récepteurs de l'angiotensine II (Ang II) dans le cerveau de rat en utilisant un radioligand spécifique pour les récepteurs de l'angiotensine II pour effectuer la cartographie des récepteurs autoradiographique.
Les échantillons de tissus sont prélevés et conservés à -80 ° C. Un cryostat est utilisé pour la section coronale du tissu (cerveau) et dégel monter les sections sur des lames chargées. Les coupes de tissus montées coulissantes sont incubées dans 125 I-IS-Ang II de l' Ang II radiomarquer des récepteurs. Coulisseaux adjacents sont séparés en deux ensembles: "liaison non spécifique" (PSN) en présence d'un récepteur de concentration saturante de non-radiomarquée Ang II, ou un type AT 1 du récepteur angiotensine II (AT 1 R) , antagoniste sélectif des récepteurs de l' angiotensine II , et «liaison totale» sans AT 1 R antagoniste. Une concentration saturante d'AT 2 sous – type de récepteur angiotensine II (AT 2 R) antagoniste (de PD123319 10 uM) est également présent dans le incubatisur le tampon pour limiter 125 I-SI-Ang liaison à l'AT 1 R sous – type II. Pendant 30 minutes de pré-incubation à ~ 22 ° C, les lames NSP sont exposées à 10 uM PD123319 et losartan, tandis que «liaison totale» lames sont exposées à 10 uM PD123319. Les lames sont ensuite incubés avec 125 I-SI-Ang II en présence du PD123319 pour ' la liaison totale », et PD123319 et losartan pour NSP dans le tampon d'essai, suivi de plusieurs« lavages »dans un tampon, et de l' eau pour éliminer le sel et non spécifiquement lié radioligand. Les lames sont séchées à l'aide d'un sèche-soufflage, puis exposés à un film d'autoradiographie en utilisant un film spécialisé et d'une cassette. Le film est développé et les images sont numérisées dans un ordinateur pour la densitométrie visuelle et quantitative en utilisant un système d'imagerie propriétaire et une feuille de calcul. Un ensemble supplémentaire de diapositives sont thionine-colorées pour les comparaisons histologiques.
L'avantage d'utiliser une autoradiographie du récepteur est la capacité à visualiserAng II récepteurs in situ, au sein d' une section d'un échantillon de tissu et anatomiquement identifier la région du tissu en le comparant à une coupe histologique adjacente de référence.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires continue d'être la principale cause de décès et d' invalidité aux Etats-Unis, causant plus de 30% des décès aux États – Unis en 2011 1. Les statistiques les plus récentes de l'American Heart Association indique que plus d'une personne sur trois a un ou plusieurs types de maladies cardiovasculaires. la recherche cardiovasculaire continue à faire des progrès contre la compréhension de cette maladie, mais que les générations commencent vieillit, il est impératif de poursuivre ces efforts. Le système rénine-angiotensine (SRA) joue un rôle central dans la régulation du système cardio – vasculaire principalement par la promotion de l' athérosclérose, l' inflammation, la vasoconstriction systémique et l' activation du système nerveux sympathique (Figure 1) 2-8.
RAS est un système hormonal qui est activé lorsque les cellules juxtaglomérulaires du rein sécrètent la rénine dans le sang en réponse à la diminution de la pression sanguine, une augmentation sympatla stimulation hetic ou diminution du flux de sodium par la macula densa. Métabolise rénine angiotensinogène (synthétisé dans le foie) pour former de l'angiotensine I (Ang I). Ang I est ensuite métabolisé par l'enzyme de conversion (ACE), un ectoenzyme sur le côté luminale des cellules endothéliales vasculaires, principalement dans les poumons et les reins, pour former l'angiotensine II (Ang II), le principal peptide effecteur du RAS. Ang II est capable d'activer deux sous-types de récepteurs; le récepteur de type 1 (AT 1 R) et le récepteur de type 2 (AT 2 R), les deux qui régulent le système cardio – vasculaire, maintenir l' homéostasie hydrique et électrolytique et sont maintenant considérés pour affecter la fonction cognitive et la maladie neurodégénérative traite 8,9. A, RAS spécifique du cerveau local est rapporté pour synthétiser indépendamment Ang II. Dans le cerveau, l'angiotensinogène protéine précurseur est synthétisée dans les astrocytes 10 converti en angiotensine I par la rénine d' une enzyme analogue 3, éventuellement prorénine lié au récepteur de la prorénine11, et par la suite convertie en angiotensine II par l' enzyme de conversion de l' angiotensine , qui est abondamment exprimé sur la surface extracellulaire de neurones dans le cerveau 12. Ce intrabrain généré Ang II est l'agoniste pour le cerveau AT 1 et AT 2 récepteurs qui sont isolés à partir du sang transmis par Ang II.
Alors que l'AT 1 R joue un rôle physiologique important, il est mieux connu pour ses effets physiopathologiques dans tout le corps, affectant principalement le système cardio – vasculaire et les reins (figure 2). Lorsque Ang II se lie à l'AT 1 R, il provoque une vasoconstriction; augmentation de la résistance à la circulation sanguine et d'élever la pression artérielle. Elle favorise également la synthèse et la sécrétion d'aldostérone et la vasopressine, conduisant à une augmentation de sodium et la rétention d'eau. Ces effets peuvent également induire des lésions cérébrales ischémiques et les troubles cognitifs et est liée à la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, et Diabetes, ainsi que d' être récemment identifié à affecter l' apprentissage et de la mémoire 13-15. Il y a une boucle de rétroaction dans le RAS en ce que R 1 sur les cellules juxtaglomérulaires du rein inhibe la sécrétion de rénine. Fait intéressant, AT 2 R généralement contre-régule l'action d'AT 1 R, ce qui provoque la vasodilatation, la croissance des neurites, la régénération axonale, anti-prolifération et cerebroprotection parmi beaucoup d' autres 16-20. AT R 2 a également été identifié comme une cible pour l' anti-hypertension et , plus récemment, des médicaments anticancéreux 21. Détermination de la localisation et la densité des récepteurs Ang II dans les différents tissus et comment ils sont touchés par divers traitements et états pathologiques en utilisant quantitative autoradiographie des récepteurs densitométrique va aider à découvrir le rôle du RAS joue dans des maladies spécifiques.
Récepteur autoradiographie a été utilisé pendant plus de 30 ans comme une méthode efficace pour indiquer la présence de l'angiotensine II récepteurs et d' autres composants de la RAS dans le cerveau et d' autres tissus du rat, souris, cochon de Guinée, le chien et l' homme sous une variété de conditions expérimentales 22-34. L'importance de la localisation des récepteurs Ang II dans le cerveau est que l' on peut appliquer neuroanatomie fonctionnelle aux actions de Ang II dans le cerveau, par exemple, la présence d'AT 1 R dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus (PVN) suggère une fonction d'Ang II dans le cerveau pour stimuler la vasopressine, l'ocytocine ou de l'hormone de libération de la corticotropine (CRH) de presse, ou l'activation du système nerveux sympathique. Ainsi, les médicaments qui bloquent l'AT 1 R pourraient diminuer certains de ces effets PVN médiées associés avec plus de l' activité des RAS du cerveau. Les travaux en cours suggèrent que l'utilisation d'AT 1 R antagonistes peut diminuer Post-Traumatic Stress Disorder (PTSD) la libération induite par la CRH et améliorer les symptômes de stress post – traumatique (Hurt et al., Soumis pour publication). Le PVN, subfornicalorgane (SFO), et l'amygdale sont connus pour réguler l'homéostasie, l'appétit / soif, le sommeil, la mémoire, les réactions émotionnelles, et sont les zones cibles de cette étude de démonstration. Ces régions ont été examinées par la collecte des coupes coronales d'un cerveau sur des lames de microscope, et le traitement des sections avec des inhibiteurs spécifiques avec un radioligand spécifique des récepteurs Ang II. Dans cette étude, tous les matériaux et les réactifs ainsi que les fournisseurs suggérés sont répertoriés, l' iode-125 a été utilisé pour radiomarquer un antagoniste de l' angiotensine II du récepteur, la sarcosine 1, l' isoleucine 8 Ang II (SI Ang II), qui a été ensuite purifié comme mono 125I -SI Ang II en utilisant des méthodes HPLC comme décrit précédemment 35. L'utilisation de cette activité radioligand spécifique élevée permet la visualisation des zones de faible densité, modérée et élevée du récepteur après exposition des sections radiomarqués à un film x-ray. En calibrant le film avec les normes de pâte du cerveau contenant des quantités connues d'iode-125, le montant spécifiquedu récepteur Ang II de liaison dans une zone peut être quantifiée. Dans des études expérimentales, le récepteur de liaison de l'angiotensine II dans le cerveau des sujets expérimentaux peut être comparée à celle dans les cerveaux de sujets témoins. Cela peut indiquer si les actions de Ang II sont modifiées en réponse à une maladie génétique, anomalie phénotypique, l'état de la maladie ou un traitement médicamenteux. Cette connaissance peut alors être appliquée sur le développement de thérapies pour traiter des maladies associées à une dérégulation de la RAS. Des techniques alternatives qui permettent d' identifier les sites de liaison au récepteur, mais avec une résolution anatomique réduite, sont des dosages qui utilisent des préparations de membranes de tissu provenant d'homogénats de tissus, qui sont mises en incubation avec le radioligand sur une plage de concentrations afin d' évaluer l' affinité de liaison de radioligand comme la constante de dissociation (K D lient ) et une capacité de liaison maximale (B max) du tissu d'intérêt.
Le protocole décrit ici peut être décomposé en 5 co majeuremponents: Préparation de coupes de tissus pour des récepteurs autoradiographie; Receptor autoradiographie; Exposition du film et le développement; Histologie; et densitométrique Analyse d'image.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit identifie la visualisation de «total» et «non spécifique» de liaison du radioligand dans des sections adjacentes de coupes coronales d'un cerveau de rongeur précédemment récolté et stocké à -80 ° C, et peut être facilement applicable à pratiquement tous les tissus qui a anatomiquement résolu substructures qui affichent des montants différentiels des récepteurs ou des sites de liaison de radioligands. Les procédures décrites dans le protocole sont simples et l'analyse est e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grant HL-113905
Materials
| 500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
Riferimenti
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