base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

Summary

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

Abstract

Cette méthode décrit une chromatographie sensible, spécifique, fiable et reproductible en phase inverse liquide à haute performance (HPLC-RP) l'essai développé et validé pour la quantification des nucleotides extracellulaires puriques et les nucléosides produites par purifiée leucémie lymphoïde chronique (CLL), les cellules dans différentes conditions de culture . La séparation chromatographique de l'adénosine 5'-monophosphate (AMP), l'adénosine (ADO) et inosine (INO) est effectuée à la température ambiante sur une colonne en phase inverse à base de silice qui est utilisé pour la rétention du composé polaire. Le procédé comprend une phase mobile binaire, qui est constitué d'acétate d'ammonium à 7 mM et de l'acétonitrile à un débit de 1,00 ml / min de débit. Les éluats sont surveillés à l'aide d'un détecteur UV Photodiode Array fixé à 260 nm. Une courbe d'étalonnage est générée pour calculer l'équation analytique pour la quantification de chaque composé de purine. le contrôle du système, l'acquisition de données et l'analyse sont ensuite effectuées. L'application de ce protocole, AMP, INO et ADO éluent à 7, 11 et 11,9 min, respectivement, et le temps total de course pour chaque échantillon est de 20 min. Ce protocole peut être appliqué à différents types de cellules et de lignées cellulaires (à la fois en suspension et adhérents), en utilisant des milieux de culture comme matrice. Les avantages sont la préparation des échantillons faciles et rapides et que l'exigence d'une faible quantité de surnageant pour l'analyse. En outre, l'utilisation d'un milieu exempt de sérum permet de sauter l'étape de précipitation des protéines avec de l'acétonitrile qui influe sur la concentration finale des composés de purine. L'une des limites de la méthode est l'exigence de la colonne d'équilibration exécuter avant chaque exécution d'un seul échantillon, ce qui rend le temps total d'exécution de l'expérience plus longue et la prévention des applications de criblage à haut débit.

Introduction

Adenosine (ADO) est une purine nucléoside avec une molécule d'adénine attachée à un fragment de molécule de sucre ribose par une liaison glycosidique. Lorsqu'ils sont présents dans le milieu extracellulaire, elle protège les cellules contre les dommages excessifs par l'action du système immunitaire. Ce rôle a été mis en évidence en utilisant différents modèles de maladies, telles que la colite ^{1, 2} diabète, l' asthme ^3, la septicémie ⁴ et ⁵ lésion ischémique. L' une des principales fonctions d'ADO est l'inhibition des réponses immunitaires dans le microenvironnement de la tumeur, ce qui contribue à la tumeur évasion immunitaire ^6. Pour cette raison, les mécanismes impliqués dans la formation ADO et la signalisation sont d' un intérêt thérapeutique considérable ^7.

ADO niveaux dans le microenvironnement des tissus sont relativement faibles dans des conditions physiologiques normales, et certainement inférieure au seuil de sensibilité des cellules immunitaires. Cependant, au cours de l'hypoxie, l'ischémie, l'inflammation, l'infection, métaboliquele stress et la transformation tumorale , ils augmentent rapidement ^8. Les niveaux d'ADO extracellulaires élevées en réponse à des signaux de tissu perturbant ont une double fonction: signaler une lésion tissulaire de façon autocrine et paracrine et pour générer des réponses tissulaires qui peuvent être généralement considérés comme cytoprotecteur.

Extracellulaires ADO peut être formé par une variété de mécanismes, qui comprennent la libération des compartiments intracellulaires médiés par les transporteurs de nucléosides ⁹ ou accumulation en raison de la dégradation altérée exploité par l' adénosine désaminase. La voie principale menant à une augmentation des niveaux extracellulaires ADO implique l'action d'une cascade de ectonucléotidases, qui sont associées à la membrane ectoenzymes générant ADO par phosphohydrolysis de nucléotides libérés de cellules mortes ou mourantes. Cette voie passe par l'action séquentielle de CD39 (triphosphate ectonucleoside diphosphohydrolase-1) qui convertit l'adénosine extracellulaire 5'-triphosphate (ATP) ou l' adénosine 5'-diphosphate (ADP) en adénosine 5'-monophosphate (AMP) et de CD73 (5'-nucléotidase) qui transforme l' AMP à ¹⁰ ADO.

Extracellulaires ADO provoque ses réactions physiologiques en se liant à quatre transmembranaire ADO récepteurs, à savoir A1, A2A, A2B et A3. Chaque récepteur a des affinités différentes pour ADO et la distribution des tissus spécifiques. Tous les récepteurs ont sept domaines transmembranaires et sont couplés aux protéines G à des protéines de liaison au GTP intracellulaire (protéines G), qui peut induire (protéine Gs) ou à inhiber (Gi protéine) activité de l'adénylate cyclase et, par la suite, la production d'AMPc intracellulaire. Par conséquent, les changements de l' impact cytoplasmique des taux d'AMPc sur l' activité protéine kinase intracellulaire pendant ¹¹ réponses physiologiques. Dans des conditions physiologiques ADO extracellulaire est inférieure à 1 uM, qui peut activer indifféremment A1, A2A et récepteurs A3. Cependant, l'activation du sous-type A2B nécessite considérablement plus élevésLes concentrations du nucleoside, tels que ceux produits dans des conditions physiopathologiques. En variante, OAD extracellulaire peut être dégradée à l'inosine (INO) par l'adénosine désaminase (ADA) et de CD26, une protéine ADA complexant localisant l'ADA sur la surface cellulaire. Une autre possibilité est que ADO est internalisé par la cellule par les transporteurs de nucléosides (ORL) et phosphorylée à AMP par ADO protéine kinase ^12,13.

L'objectif de ce protocole est de décrire une méthode d'analyse de la chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour quantifier en un seul passage AMP du substrat et des produits ADO et INO, telle que générée par les lymphocytes humains. Notre expérience a été initialement obtenue en utilisant des cellules de patients chroniques leucémie lymphoïde (CLL), qui sont caractérisés par l'expansion d'une population mature de lymphocytes CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B exprimant constitutivement CD39 ^14,15. Nous avons montré environ 30%des CLL patients expriment le ectoenzyme CD73 et que ce phénotype est corrélée à un mauvais pronostic ^16. Cette sous-population de cellules leucémiques co-exprimant CD39 et CD73 peut activement produire ADO extracellulaire d'ADP et / ou AMP. La pré – incubation de cellules CD73 ⁺ leucémiques avec des α, la synthèse d'ADO extracellulaire β-méthylène-ADP (PCAP), un inhibiteur connu de l' activité enzymatique CD73, bloque complètement confirmant que l'enzyme CD73 représente un goulot d'étranglement de cette cascade ^16.

les cellules CLL expriment également ADA et l'ADA protéine complexant CD26, qui sont responsables de la conversion de ADO dans INO. En utilisant des inhibiteurs de l'ADA spécifiques, tels que érythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) Je wiadenine (EHNA) et du chlorhydrate désoxycoformycine (FNC), il est possible de bloquer la dégradation ADO extracellulaire dans INO. En outre, le prétraitement avec un inhibiteur de l'ADA, en combinaison avec le dipyridamole, qui bloque les transporteurs de nucléosides, augmente l'accumulation dans la cellule ADOsurnageants.

Nous avons ensuite étendu ce protocole à des cellules dérivées d'autres lignées, y compris les lymphocytes T et les cellules myéloïdes, confirmant la production d'ADO CD73-dépendante. Ces résultats suggèrent que ce protocole HPLC est très polyvalent et qu'il peut être appliqué à différentes lignées cellulaires et à différentes conditions de culture (figure 1).

Figure 1. Représentation schématique de la machinerie enzymatique responsable de la production ADO extracellulaire. Adenosine 5'-triphosphate (ATP) et / ou l' adénosine 5'-diphosphate (ADP) peut être dégradé par CD39 à l' adénosine 5'-monophosphate (AMP), qui à son tour, est converti par CD73 dans l'adénosine nucléoside (ADO). Une fois que ADO est produite dans l'espace extracellulaire, elle peut rentrer dans la cellule par les transporteurs de nucléosides (ENT), être converti en l'inosine (INO) oulier à différents types de récepteurs P1 ADO. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

des échantillons de sang de CLL sont obtenus conformément aux lignes directrices institutionnelles et de la Déclaration d'Helsinki. 1. Isolement des leucémique Lymphocytes d'échantillons de sang de patients atteints de LLC Prélever un échantillon de sang dans l' héparine de sodium (vert-top) tube 17. Faire dilution 1: 3 de sang total avec RT 1x tampon phosphate salin (PBS). On purifie des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir…

Representative Results

Pour évaluer le pourcentage (%) de cellules leucémiques dans les CMSP fraîchement purifiés à partir d'un patient atteint de CLL représentative, les cellules sont marquées avec des anticorps anti-CD5 et anti-CD19. Le panneau de gauche de la figure 3 représente un tracé de points cytofluorimétrique avec une porte sélective sur des cellules vivantes. La figure 3 montre un exemple de PBMC d'un patient CLL avant (panneau du milieu) et aprè…

Discussion

Le protocole décrit ici permet d'évaluer l'activité du CD39 / CD73 machines adénosinergique dans des milieux de culture cellulaire à partir de cellules leucémiques humaines purifiées. Grâce à cette méthode HPLC, nous pouvons suivre et mesurer quantitativement la production enzymatique de ADO (CD73-dépendant) et sa dégradation subséquente à l'INO (CD26 / ADA dépendant). L'utilisation d'inhibiteurs de l'enzyme permet de contrôler le protocole et d'avoir des contrôles internes. …

Materials

Human blood
Milli-Q water	Millipore		double deionised water
Ficoll-Paque Plus	GE-Healthcare	17-1440-03
purified anti-CD3, -CD14, -CD16	made in-house		mouse monoclonal
PE-labeled anti-CD19	Miltenyi Biotec	120-014-229
FITC-labeled anti-CD5	Miltenyi Biotec	130-096-574
Dynabeads sheep anti-mouse IgG	Invitrogen	11031
Phosphate-buffered saline (PBS)	Amresco	E404-200TABS	tablets
bovine serum albumin (BSA)	ID bio	1000-70	standard grade
isolation buffer			PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4
AIM V serum free medium	GIBCO	12055-091	liquid (research grade)
adenosine 5’-diphosphate (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
adenosine 5’-monosphate (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adenosine (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosine (INO)	Sigma-Aldrich	I4125
α,β-methylene-ADP (APCP)	Sigma-Aldrich	M8386	CD73 inhibitor
EHNA hydrochloride	Sigma-Aldrich	E114	adenosine deaminase inhibitor
Deoxycoformycin (dCF)	Tocris	2033	adenosine deaminase inhibitor
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dipyridamole	Sigma-Aldrich	D9766	nucleoside transporter inhibitor
acetonitrile (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	34998	HPLC-grade
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	9688	7 mM, pH 3.0
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721-1L	min. 37 %
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bürker cell counter	VWR	631-0920	hemocytometer
DynaMag-15 Magnet	Invitrogen	12301D	Dynal magnetic bead separator
microcentrifuge safe-lock tubes	Eppendorf	030-120-0086	1.5 ml
PET centrifuge tubes	Corning	430053/430304	15 – 50 ml
Minisart RC4 syringe filters	Sartorius Stedim Biotech	17821	membrane 0.2 µm
short thread vials	VWR	548-0029	1.5 ml/glass
micro-inserts	VWR	548-0006	0.1 ml/glass
screw caps	VWR	548-0085	9 mm/PP blue
Atlantis dC18 Column	Waters	186001344	5 µm, 4.6 x 150 mm
Atlantis dC18 Guard Column	Waters	186001323	5 µm, 4.6 x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separations Module	Waters		HPLC separation module
Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector	Waters		UV detector
Waters Empower2 software	Waters