HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

Summary

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

Abstract

Dieses Verfahren beschreibt eine empfindliche, spezifische und zuverlässige und reproduzierbare Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) -Test entwickelt und von gereinigtem chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen produziert für die Quantifizierung von extrazellulärem Purin Nukleotiden und Nukleosiden validiert . Die chromatographische Trennung von Adenosin-5'-monophosphat (AMP), Adenosin (ADO) und Inosin (INO) wird bei RT auf einem Siliciumdioxid-Basis, Umkehrphasen-Säule durchgeführt, die für die polare Verbindung Retention verwendet wird. Das Verfahren umfasst einen binären mobile Phase, die mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,00 ml / min von 7 mM Ammoniumacetat und Acetonitril besteht. Die Eluate werden überwacht, um einen Photodiodenarray-UV-Detektor unter Verwendung von bei 260 nm eingestellt. Eine Standard-Kalibrierungskurve erzeugt, um die Gleichung für die analytische Quantifizierung jedes Purinverbindung zu berechnen. System Steuerung, Datenerfassung und -analyse werden dann durchgeführt. Die Anwendung dieses Protokolls, AMP, INO und ADO eluieren bei 7, 11 und 11,9 min, und die Gesamtlaufzeit für jede Probe beträgt 20 min. Dieses Protokoll kann in verschiedene Zelltypen und Zelllinien (sowohl Suspensions- und adhärente) angewendet werden, als Kulturmedien Matrix. Die Vorteile sind eine einfache und schnelle Probenvorbereitung und das Erfordernis einer geringen Menge an Überstand für die Analyse. Weiterhin ermöglicht die Verwendung eines serumfreien Medium, das Protein-Fällungsschritt mit Acetonitril Skipping, die Auswirkungen auf die Endkonzentration von Purinverbindungen. Eine der Einschränkungen des Verfahrens ist die Forderung der Säule Ausgleich vor jeder einzelnen Probe Lauf laufen, die Gesamtlaufzeit des Experiments mehr machen und Hochdurchsatzscreening-Anwendungen zu verhindern.

Introduction

Adenosine (ADO) ist ein Purin-Nukleosid mit einem Adenin-Molekül an einem Ribose Molekülteil durch eine glycosidische Bindung. Wenn sie vorhanden sind in der extrazellulären Umgebung, schützt Zellen vor übermäßigen Beschädigung durch die Wirkung des Immunsystems. Diese Rolle wurde mit verschiedenen Krankheitsmodellen hervorgehoben, wie Colitis ^1, Diabetes ^2, Asthma ^3, Sepsis ⁴ und ischämische Verletzung ^5. Eine der Hauptfunktionen ADO ist die Hemmung von Immunreaktionen in der Tumor – Mikroumgebung, einen Beitrag zur Tumor Immunevasion ^6. Aus diesem Grund sind die beteiligten Mechanismen in ADO Bildung und Signalisierung von erheblicher therapeutischem Interesse ^7.

ADO-Spiegel im Gewebe Mikroumgebung sind relativ gering unter normalen physiologischen Bedingungen und mit Sicherheit unterhalb der Nachweisgrenze von Immunzellen. Jedoch während Hypoxie, Ischämie, Entzündung, Infektion, StoffwechselStress und Tumortransformation sie schnell zu erhöhen ^8. Die erhöhten extrazellulären ADO Ebenen in Reaktion auf gewebe Störsignale haben eine Doppelfunktion: Gewebeverletzung in einer autokrinen und parakrinen Weise zu berichten und Gewebereaktionen zu erzeugen, die im Allgemeinen als zytoprotektive betrachtet werden können.

Die extrazelluläre ADO kann durch eine Vielzahl von Mechanismen gebildet werden, die die Freisetzung umfassen von intrazellulären Kompartimenten vermittelt durch Nukleosid – Transporter ⁹ oder Anhäufung wegen gestörten Abbau von Adenosindeaminase betrieben. Der Hauptweg zu einer erhöhten extrazellulären ADO-Niveaus führt beinhaltet die Wirkung einer Kaskade von ectonucleotidases, welche Membran Ectoenzyme assoziiert ADO durch phosphohydrolysis von Nukleotiden veröffentlicht von toten oder sterbenden Zellen zu erzeugen. Dieser Weg verläuft durch die sequentielle Wirkung von CD39 (ectonucleoside Triphosphat diphosphohydrolase-1), die 5'-triphosphat extrazellulärem Adenosin umwandelt (ATP) oder Adenosin – 5'-diphosphat (ADP) zu Adenosin – 5'-Monophosphat (AMP) und CD73 (5'-nucleotidase), die AMP wandelt ¹⁰ bis ADO.

Die extrazelluläre ADO entlockt seiner physiologischen Reaktionen von vier Trans ADO Rezeptoren binden, nämlich A1, A2A, A2B und A3. Jeder Rezeptor hat unterschiedliche Affinitäten für ADO und spezifische Gewebeverteilung. Alle Rezeptoren besitzen sieben Transmembrandomänen und sind G-Protein-gekoppelten intrazellulären GTP-bindende Proteine ​​(G-Proteine), die veranlassen können (Gs-Protein) oder inhibieren (Gi-Protein) Adenylat-Cyclase-Aktivität und anschließend die Produktion von intrazellulärem cAMP. Daher ändert in cytoplasmatischen cAMP Niveaus Einfluss auf die intrazelluläre Protein – Kinase – Aktivität während der physiologischen Reaktionen ^11. Unter physiologischen Bedingungen ist extrazelluläre ADO unter 1 & mgr; M, die wahllos A1, A2A und A3-Rezeptoren aktivieren kann. Jedoch erfordert die Aktivierung von A2B-Subtyp wesentlich höherKonzentrationen des Nukleosids, wie die unter pathophysiologischen Bedingungen erzeugt. Alternativ kann extrazellulär ADO zu Inosin (INO) durch Adenosin-Deaminase (ADA) und CD26 abgebaut werden, ein ADA komplexierende Protein lokalisierende ADA auf der Zelloberfläche. Eine andere Möglichkeit ist , dass ADO von der Zelle durch die äquilibrierenden Nukleosid – Transporter (ENT) und phosphoryliert zu AMP durch ADO – Kinase Protein ^12,13 internalisiert wird.

Das Ziel dieses Protokolls ist eine analytische Methode der Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC) zu beschreiben, in einem einzigen Durchlauf des Substrats AMP und die Produkte ADO und INO, zu quantifizieren, wie durch menschliche Lymphozyten erzeugt. Unsere Erfahrung war zunächst erhaltenen Zellen von chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) mit, die durch die Expansion eines reifen Population von CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B – Lymphozyten konstitutiv gekennzeichnet exprimieren CD39 ^14,15. Wir zeigten etwa 30%Patienten von CLL exprimieren das CD73 Ektoenzym und dass dieser Phänotyp korreliert mit einer schlechten Prognose ^16. Diese Subpopulation von leukämischen Zellen co-exprimierenden CD39 und CD73 können aktiv extrazelluläre ADO von ADP und / oder AMP produzieren. Vorinkubation von CD73 ⁺ CLL – Zellen mit α, β-Methylen-ADP (APCP), ein bekannter Inhibitor der CD73 enzymatischer Aktivität, vollständig blockiert extrazellulärem ADO Synthese bestätigt , dass CD73 die Flaschenhals – Enzym dieser Kaskade ¹⁶ darstellt.

CLL-Zellen exprimieren auch ADA und die ADA Komplexbildung Protein CD26, die für die Umwandlung von ADO in INO verantwortlich sind. Durch die Verwendung von spezifischen ADA-Inhibitoren, wie erythro-9- (2-Hydroxy-3-nonyl) I wiadenine (EHNA) hydrochlorid und Desoxycoformycin (dCF) ist es möglich, extrazelluläre ADO Degradation INO zu blockieren. Weiterhin Vorbehandlung mit einem ADA-Inhibitor in Kombination mit Dipyridamol, dass Nukleosid-Transporter-Blöcke erhöht ADO Akkumulation in ZellenStände.

Wir haben dann dieses Protokoll zu Zellen von anderen Abstammungslinien, einschließlich T-Lymphozyten und myeloischen Zellen, bestätigt CD73-abhängige ADO Produktion abgeleitet erweitert. Diese Ergebnisse legen nahe , dass diese HPLC – Protokoll sehr vielseitig ist und dass es an verschiedene Zelllinien angewendet werden kann und auf unterschiedliche Kulturbedingungen (Abbildung 1).

Abbildung 1. Schematische Darstellung der enzymatischen Maschinerie verantwortlich für extrazelluläre ADO – Produktion. Adenosin – 5'-Triphosphat (ATP) und / oder Adenosin – 5'-diphosphat (ADP) durch CD39 an Adenosin – 5'-Monophosphat (AMP) abgebaut werden, die wiederum von CD73 in das Nukleosid Adenosin (ADO) umgewandelt. Sobald ADO in den extrazellulären Raum erzeugt wird, kann es die Zelle durch die Nukleosid-Transporter (ENT) erneut einzugeben, in Inosin umgewandelt werden (INO) oderbinden an verschiedene Typen von P1 ADO – Rezeptoren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

CLL Blutproben werden gemäß den Richtlinien des Instituts und Deklaration von Helsinki erhalten. 1. Isolierung von leukämischen Lymphozyten aus Blutproben von CLL-Patienten Sammeln Blutprobe in Heparin – Natrium (grün-top) Rohr 17. Machen 1: 3-Verdünnung von Vollblut mit RT 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Reinige peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) aus Blutproben durch Dichtegradientenzentrifugation. Underlay 5 ml Dichtezentrifugation …

Representative Results

Um den Prozentsatz (%) der leukämischen Zellen in frisch gereinigtem PBMCs aus einem repräsentativen CLL Patienten zu bewerten, werden die Zellen markiert mit Anti-CD19 und anti-CD5 Antikörper. Der linke Teil von Abbildung 3 stellt einen cytofluorimetric Punktdiagramm mit einem selektiven Gate an lebenden Zellen. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel von PBMC von einem CLL Patienten vor (Mitte) und nach (rechts) B – Zell – Reinigung. <p class="jove_conte…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es, die Aktivität des CD39 / CD73 adenosinergen Maschinen in Zellkulturmedien aus gereinigtem menschlichen leukämischen Zellen zu bewerten. Durch diese HPLC-Methode können wir folgen und messen quantitativ die enzymatische Erzeugung von ADO (CD73 abhängig) und dessen anschließende Abbau zu INO (CD26 / ADA abhängig). Die Verwendung von Enzyminhibitoren ermöglicht, das Protokoll zu steuern, und interne Kontrollen zu haben. Die Vorteile und die Neuheiten des Protokolls sin…

Materials

Human blood
Milli-Q water	Millipore		double deionised water
Ficoll-Paque Plus	GE-Healthcare	17-1440-03
purified anti-CD3, -CD14, -CD16	made in-house		mouse monoclonal
PE-labeled anti-CD19	Miltenyi Biotec	120-014-229
FITC-labeled anti-CD5	Miltenyi Biotec	130-096-574
Dynabeads sheep anti-mouse IgG	Invitrogen	11031
Phosphate-buffered saline (PBS)	Amresco	E404-200TABS	tablets
bovine serum albumin (BSA)	ID bio	1000-70	standard grade
isolation buffer			PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4
AIM V serum free medium	GIBCO	12055-091	liquid (research grade)
adenosine 5’-diphosphate (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
adenosine 5’-monosphate (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adenosine (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosine (INO)	Sigma-Aldrich	I4125
α,β-methylene-ADP (APCP)	Sigma-Aldrich	M8386	CD73 inhibitor
EHNA hydrochloride	Sigma-Aldrich	E114	adenosine deaminase inhibitor
Deoxycoformycin (dCF)	Tocris	2033	adenosine deaminase inhibitor
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dipyridamole	Sigma-Aldrich	D9766	nucleoside transporter inhibitor
acetonitrile (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	34998	HPLC-grade
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	9688	7 mM, pH 3.0
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721-1L	min. 37 %
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bürker cell counter	VWR	631-0920	hemocytometer
DynaMag-15 Magnet	Invitrogen	12301D	Dynal magnetic bead separator
microcentrifuge safe-lock tubes	Eppendorf	030-120-0086	1.5 ml
PET centrifuge tubes	Corning	430053/430304	15 – 50 ml
Minisart RC4 syringe filters	Sartorius Stedim Biotech	17821	membrane 0.2 µm
short thread vials	VWR	548-0029	1.5 ml/glass
micro-inserts	VWR	548-0006	0.1 ml/glass
screw caps	VWR	548-0085	9 mm/PP blue
Atlantis dC18 Column	Waters	186001344	5 µm, 4.6 x 150 mm
Atlantis dC18 Guard Column	Waters	186001323	5 µm, 4.6 x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separations Module	Waters		HPLC separation module
Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector	Waters		UV detector
Waters Empower2 software	Waters