HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

Summary

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

Abstract

Questo metodo descrive una fase di inversione di cromatografia sensibili, specifiche, affidabile e riproducibile liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) test sviluppato e validato per la quantificazione dei nucleotidi extracellulari purine e nucleosidi prodotti da purificata leucemia linfatica cronica (LLC), le cellule in diverse condizioni di coltura . La separazione cromatografica di adenosina 5'-monofosfato (AMP), adenosina (ADO) e inosina (INO) viene eseguita a temperatura ambiente su una colonna a fase inversa a base di silice che viene utilizzato per ritenzione dei composti polari. Il metodo comprende una fase mobile binario, che consiste di ammonio acetato 7 mM e acetonitrile con una portata di 1,00 ml / min. Gli eluati sono monitorati utilizzando un rivelatore UV fotodiodi fissato a 260 nm. Una curva di calibrazione standard è generata per calcolare l'equazione per la quantificazione analitica di ciascun composto purine. Sistema di controllo, acquisizione e analisi dei dati vengono eseguite. L'applicazione di questo protocollo, AMP, INO e ADO eluiscano a 7, 11 e 11,9 min, rispettivamente, e il tempo di esecuzione totale per ogni campione è 20 min. Questo protocollo può essere applicato a diversi tipi di cellule e linee cellulari (sia di sospensione e di aderenti), utilizzando terreni di coltura come matrice. I vantaggi sono facile e veloce preparazione del campione e l'esigenza di una piccola quantità di surnatante per l'analisi. Inoltre, l'uso di un mezzo privo di siero permette saltando il passo proteine ​​precipitazione con acetonitrile che impatta la concentrazione finale dei composti purinici. Uno dei limiti del metodo è il requisito della colonna equilibrio eseguire prima di ogni singola esecuzione del campione, rendendo il tempo di esecuzione totale dell'esperimento più a lungo e prevenire le applicazioni di screening ad alto rendimento.

Introduction

L'adenosina (ADO) è un nucleoside purinico con una molecola di adenina attaccato ad una molecola di residuo di zucchero ribosio attraverso un legame glicosidico. Quando presenti nell'ambiente extracellulare, protegge le cellule da danni eccessivi dall'azione del sistema immunitario. Questo ruolo è stato evidenziato utilizzando diversi modelli di malattie, come la colite ^1, il diabete ^2, asma ^3, sepsi ⁴ e ⁵ danno ischemico. Una delle principali funzioni ADO è l'inibizione delle risposte immunitarie nel microambiente tumorale, contribuendo al tumore evasione immune ^6. Per questo motivo, i meccanismi coinvolti nella formazione ADO e segnalazione sono di notevole interesse terapeutico ^7.

i livelli di ADO nel microambiente tissutale sono relativamente bassi in condizioni fisiologiche normali e certamente al di sotto della soglia di sensibilità delle cellule immunitarie. Tuttavia, durante l'ipossia, ischemia, infiammazioni, infezioni, metabolichelo stress e la trasformazione tumorale che aumentano rapidamente ^8. Gli elevati livelli di ADO extracellulari in risposta a segnali di tessuto-perturbante hanno una doppia funzione: da segnalare lesioni dei tessuti in modo autocrino e paracrino e per generare le risposte del tessuto che possono essere visti in generale come cytoprotective.

Extracellulare ADO può essere formato attraverso una varietà di meccanismi, che comprendono il rilascio da compartimenti intracellulari mediati da trasportatori nucleosidici ⁹ o accumulo a causa del degrado compromessa gestito da adenosina deaminasi. La via principale che porta a un aumento dei livelli extracellulari ADO comporta l'azione di una cascata di ectonucleotidases, che sono associati a membrana ectoenzimi generano ADO phosphohydrolysis di nucleotidi rilasciati dalle cellule morte o morenti. Questo percorso procede attraverso l'azione sequenziale di CD39 (trifosfato ectonucleoside difosfoidrolasi-1) che converte extracellulare adenosina 5'-trifosfato (ATP) o adenosina 5'-difosfato (ADP) di adenosina 5'-monofosfato (AMP) e CD73 (5'-nucleotidasi), che converte AMP ad ADO ^10.

Extracellulare ADO suscita le sue risposte fisiologiche legandosi a quattro transmembrana ADO recettori, cioè A1, A2A, A2B e A3. Ogni recettore ha affinità diverse per ADO e distribuzione tissutale specifica. Tutti i recettori hanno sette domini transmembrana e sono accoppiati a proteine ​​G per intracellulari proteine ​​GTP-binding (proteine ​​G), che può indurre (proteina Gs) o inibire (Gi proteine) attività di ciclasi e, di conseguenza, la produzione di cAMP intracellulare. Pertanto, i cambiamenti nel citoplasmatica livelli di cAMP intracellulare impatto sulle attività della proteina chinasi durante risposte fisiologiche ^11. In condizioni fisiologiche ADO extracellulare è inferiore a 1 micron, che possono attivare indiscriminatamente A1, A2A e recettori A3. Tuttavia, l'attivazione di A2B sottotipo richiede notevolmente superioreconcentrazioni del nucleoside, quali quelli generati in condizioni fisiopatologiche. In alternativa, ADO extracellulare può essere degradata a inosina (INO) di adenosina deaminasi (ADA) e CD26, una proteina ADA complessante localizzazione ADA sulla superficie cellulare. Un'altra possibilità è che ADO è interiorizzato dalla cella attraverso i trasportatori equilibrativo nucleosidici (ENT) e fosforilata di AMP di ADO proteina chinasi ^12,13.

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo analitico di fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) quantificare in un'unica seduta AMP substrato e prodotti ADO e INO, come generato da linfociti umani. La nostra esperienza è stato inizialmente ottenuto con cellule di pazienti leucemia linfocitica cronica (CLL), che si caratterizzano per l'espansione di una popolazione matura di linfociti CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B che esprimono costitutivamente CD39 ^14,15. Abbiamo mostrato circa il 30%della LLC pazienti esprimono la ectoenzima CD73 e che questo fenotipo correla con una prognosi infausta ^16. Questa sottopopolazione di cellule leucemiche co-esprimono CD39 e CD73 può produrre attivamente ADO extracellulare da ADP e / o AMP. La preincubazione di cellule CD73 ⁺ CLL con α, β sintesi extracellulare ADO-metilene-ADP (APCP), un inibitore noto di CD73 attività enzimatica, blocca completamente confermando che CD73 rappresenta l'enzima strozzatura di tale cascade ^16.

cellule CLL esprimono anche ADA e l'ADA proteine ​​complessanti CD26, che sono responsabili per la conversione di ADO in INO. Utilizzando inibitori ADA specifici, come eritro-9- (2-idrossi-3-nonil) I wiadenine (EHNA) cloridrato e desossicoformicina (dCF), è possibile bloccare la degradazione ADO extracellulare in INO. Inoltre, pre-trattamento con un inibitore ADA in combinazione con dipiridamolo, che blocca trasportatori nucleosidici, aumenta l'accumulo di ADO nella cellasurnatanti.

Abbiamo poi esteso questo protocollo per le cellule derivate da altre stirpi, tra cui i linfociti T e cellule mieloidi, confermando la produzione ADO CD73-dipendente. Questi risultati suggeriscono che questo protocollo HPLC è estremamente versatile e che può essere applicata a diverse linee cellulari e per diverse condizioni di coltura (Figura 1).

Figura 1. Rappresentazione schematica del meccanismo enzimatico responsabile della produzione ADO extracellulare. Adenosina 5'-trifosfato (ATP) e / o adenosina 5'-difosfato (ADP) può essere degradata per CD39 di adenosina 5'-monofosfato (AMP), che a sua volta viene convertito dal CD73 nella adenosina nucleoside (ADO). Una volta ADO viene prodotto nello spazio extracellulare, può rientrare cella attraverso i trasportatori nucleosidici (ORL), è convertito in inosina (INO) olegarsi a diversi tipi di recettori P1 ADO. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

campioni di sangue CLL sono ottenuti in accordo con le linee guida istituzionali e Dichiarazione di Helsinki. 1. Isolamento di leucemica Linfociti da campioni di sangue di pazienti affetti da LLC Raccogliere il campione di sangue in eparina sodica (verde-top) del tubo 17. Fare 1: 3 diluizione del sangue intero con RT 1x tampone fosfato salino (PBS). Purificare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da campioni di sangue da gradiente di densità centrifugazi…

Representative Results

Per valutare la percentuale (%) di cellule leucemiche in PBMC appena purificati da un paziente rappresentante CLL, le cellule vengono marcate con anti-CD19 e anti-CD5. Il pannello di sinistra di figura 3 rappresenta un diagramma a punti citofluorimetrica con un cancello selettiva su cellule vive. La Figura 3 mostra un esempio di PBMC da un paziente CLL prima (pannello centrale) e dopo la purificazione delle cellule B (pannello destro). <p class="jove…

Discussion

Il protocollo qui descritto permette di valutare l'attività del CD39 / CD73 macchine adenosinergic in mezzi di coltura cellulare da cellule leucemiche umane purificate. Attraverso questo metodo HPLC possiamo seguire e quantitativamente misurare la generazione enzimatica di ADO (CD73-dipendente) e la sua successiva degradazione di INO (CD26 / ADA dipendente). L'uso di inibitori enzimatici permette di controllare il protocollo e di avere controlli interni. I vantaggi e le novità di questo protocollo è che i) pu…

Materials

Human blood
Milli-Q water	Millipore		double deionised water
Ficoll-Paque Plus	GE-Healthcare	17-1440-03
purified anti-CD3, -CD14, -CD16	made in-house		mouse monoclonal
PE-labeled anti-CD19	Miltenyi Biotec	120-014-229
FITC-labeled anti-CD5	Miltenyi Biotec	130-096-574
Dynabeads sheep anti-mouse IgG	Invitrogen	11031
Phosphate-buffered saline (PBS)	Amresco	E404-200TABS	tablets
bovine serum albumin (BSA)	ID bio	1000-70	standard grade
isolation buffer			PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4
AIM V serum free medium	GIBCO	12055-091	liquid (research grade)
adenosine 5’-diphosphate (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
adenosine 5’-monosphate (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adenosine (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosine (INO)	Sigma-Aldrich	I4125
α,β-methylene-ADP (APCP)	Sigma-Aldrich	M8386	CD73 inhibitor
EHNA hydrochloride	Sigma-Aldrich	E114	adenosine deaminase inhibitor
Deoxycoformycin (dCF)	Tocris	2033	adenosine deaminase inhibitor
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dipyridamole	Sigma-Aldrich	D9766	nucleoside transporter inhibitor
acetonitrile (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	34998	HPLC-grade
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	9688	7 mM, pH 3.0
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721-1L	min. 37 %
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bürker cell counter	VWR	631-0920	hemocytometer
DynaMag-15 Magnet	Invitrogen	12301D	Dynal magnetic bead separator
microcentrifuge safe-lock tubes	Eppendorf	030-120-0086	1.5 ml
PET centrifuge tubes	Corning	430053/430304	15 – 50 ml
Minisart RC4 syringe filters	Sartorius Stedim Biotech	17821	membrane 0.2 µm
short thread vials	VWR	548-0029	1.5 ml/glass
micro-inserts	VWR	548-0006	0.1 ml/glass
screw caps	VWR	548-0085	9 mm/PP blue
Atlantis dC18 Column	Waters	186001344	5 µm, 4.6 x 150 mm
Atlantis dC18 Guard Column	Waters	186001323	5 µm, 4.6 x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separations Module	Waters		HPLC separation module
Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector	Waters		UV detector
Waters Empower2 software	Waters