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Developmental Biology

आनुवंशिक मॉडल के साथ Intravital फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (IVFM) का मेल अस्थि मज्जा niches के लिए टेम कोशिकाओं के Engraftment गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए

Published: March 21, 2017 doi: 10.3791/54253
Automatic Translation
*1, *2, 3, 3
1Wells Center for Pediatric Research, Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 2Indiana Center for Biological Microscopy, Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (IVFM) calvarium के आनुवंशिक पशु मॉडल के साथ संयोजन में लागू किया जाता है डाक और अस्थि मज्जा (बीएम) niches में engraftment कोशिकाओं के टेम का अध्ययन ।

Abstract

बढ़ती सबूत इंगित करता है कि सामांय hematopoiesis बीएम, जो विशेष सेलुलर महत्वपूर्ण टेम स्टेम सेल (HSC) कार्य1,2नियमन niches में अलग microenvironmental cues द्वारा विनियमित है । दरअसल, टेम microenvironment का एक और विस्तृत चित्र अब उभर रहा है, जिसमें endosteal और endothelial niches सामांय HSC के विनियमन के लिए कार्यात्मक इकाइयों फार्म और उनकी संतान3,4,5 . नए अध्ययनों से HSC फ़ंक्शन6,7,8को बनाए रखने और विनियमित करने में perivascular कोशिकाओं, adipocytes और न्यूरॉन कोशिकाओं के महत्व का पता चला है । इसके अलावा, वहां सबूत है कि विभिंन प्रजातियों, यानी माइलॉयड और लसीकावत् कोशिकाओं, घर से कोशिकाओं और बीएम microenvironment के भीतर विशिष्ट niches में रहते हैं । हालांकि, बीएम microenvironment और उसके रहने वालों की एक पूरी मानचित्रण अभी भी प्रगति पर है ।

ट्रांसजेनिक माउस वंश विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों या आनुवंशिक रूप से बीएम आला की विशिष्ट कोशिकाओं में चयनित अणुओं के अभाव इंजीनियर चूहों व्यक्त उपभेदों अब उपलब्ध हैं । नॉक आउट और वंश ट्रैकिंग मॉडल, प्रत्यारोपण दृष्टिकोण के साथ संयोजन में, परिभाषित टेम आबादी के लिए विशिष्ट "आला" कोशिकाओं की भूमिका पर ज्ञान को परिष्कृत करने का अवसर प्रदान करते हैं, ऐसे HSC, बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, माइलॉयड कोशिकाओं और के रूप में erythroid कक्ष । इस कार्यनीति को calvarium के दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग से विलय करके आगे potentiated जा सकता है. वीवो उच्च संकल्प इमेजिंग और 3-बी बीएम calvarium के प्रतिपादन में प्रदान करके, हम अब ठीक स्थान है जहां विशिष्ट टेम बीएम में घर सेट और समय के साथ उनके विस्तार के कैनेटीक्स का मूल्यांकन निर्धारित कर सकते हैं । यहां, Lys-GFP ट्रांसजेनिक चूहों (माइलॉयड कोशिकाओं अंकन)9 और RBPJ नॉक आउट चूहों (कमी विहित पायदान संकेतन)10 IVFM के साथ संयोजन में प्रयोग किया जाता है एक पायदान दोषपूर्ण बीएम engraftment के लिए माइलॉयड कोशिकाओं के microenvironment निर्धारित करने के लिए ।

Introduction

Intravital multiphoton प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (IVFM) एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक है कि उच्च संकल्प के लिए अनुमति देता है, ऊतकों के वास्तविक समय इमेजिंग 1mm तक गहराई के साथ, ऊतक पर निर्भर करता है. जब माउस calvarium करने के लिए आवेदन किया है, यह 60-100 माइक्रोन के लिए एक गैर इनवेसिव तरीके से बीएम के भीतर टेम कोशिकाओं के व्यवहार को देख परमिट11। इस दृष्टिकोण यहां प्रयोग किया जाता है RBPJ नॉक आउट चूहों की कमी विहित पायदान संकेतन में सामान्य माइलॉयड progenitors के engraftment के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए ।

हमारे समूह से हाल ही में काम का प्रदर्शन किया है कि दोषपूर्ण विहित microenvironment में संकेतन पायदान एक myeloproliferative की ओर जाता है जैसे रोग12। पायदान संकेतन के नुकसान RBPJ के डीएनए बंधन डोमेन के सशर्त विलोपन द्वारा प्राप्त किया गया था, महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक विहित पायदान के बहाव, संकेतन, Mx1-Cre प्रेरित पुनर्संयोजन10का उपयोग कर । इस अध्ययन में, Mx1-Cre/RBPJलोक्स/लोक्स चूहों मॉडल का इस्तेमाल किया गया । सभी पायदान रिसेप्टर्स से संकेतन के नुकसान में RBPJ परिणामों की डीएनए बाइंडिंग रूपांकन के सशर्त विलोपन. Mx1-Cre मॉडल में, Cre अभिव्यक्ति Mx1 प्रवर्तक polyI के प्रशासन पर सक्रिय द्वारा संचालित है: सी रक्त कोशिकाओं में लक्षित जीन विलोपन की प्रेरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अंगों के stromal घटकों में, बीएम, तिल्ली और जिगर सहित जिसके परिणामस्वरूप ।

Mx1-Cre+/RBPJलोक्स/लोक्स और Mx1-Cre-/RBPJलोक्स/लोक्स चूहों polyI के साथ प्रेरित: सी (hereon और RBPJKO के रूप में संकेत दिया, क्रमशः) घातक RBPJWT थे और सामान्य, जंगली प्रकार विकिरणित कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित. प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह से शुरू, RBPJKO प्राप्तकर्ताओं महत्वपूर्ण तिल्ली द्वारा पीछा leukocytosis विकसित की है । हालांकि RBPJKO चूहों 8 सप्ताह में माइलॉयड progenitors के प्रत्यारोपण के बाद और बाद में समय अंक पर, बीएम का विश्लेषण 4 सप्ताह और 6 में उनकी माइलॉयड कोशिका सामग्री में हड़ताली मतभेदों को उजागर नहीं किया नियंत्रण की तुलना में वृद्धि हुई प्रतिशत प्रस्तुत RBPJWT प्राप्तकर्ताओं. इस प्रेक्षण, एक साथ तथ्य यह है कि Mx1-Cre अलग टेम अंगों में व्यक्त की है के साथ, सवाल उठाया कि क्या बीएम microenvironment myeloproliferative phenotype की दीक्षा पर सीधा प्रभाव पड़ा ।

बीएम प्रत्यारोपण (BMT), RBPJ नॉक आउट मॉडल, और एक वंश पर नज़र रखने प्रणाली के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था कि क्या यह निर्धारित करने के लिए बी एम सी रोग विकास की एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक साइट, माउस calvarium के IVFM था । ट्रांसजेनिक विशिष्ट lysozyme प्रवर्तक (Lys-GFP)9 के नियंत्रण में EGFP व्यक्त चूहों के लिए दाता कोशिकाओं है कि बीएम इमेजिंग के दौरान BMT के बाद visualized किया जा सकता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया । Lysozyme अभिव्यक्ति माइलॉयड कोशिकाओं और Lys-GFP आम माइलॉयड जनक (सीएमपी) से परिपक्व granulocyte13के लिए अंक कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है ।

IVFM अलग समय अंक पर बीएम का प्रदर्शन किया है कि Lys-GFP कोशिकाओं RBPJWT और RBPJKO प्राप्तकर्ताओं के बीएम को इसी तरह homed, लेकिन विस्तार और engrafted प्राप्तकर्ताओं के बी यह अंतर पहले समय बिंदु (2 सप्ताह) में नाटकीय था और समय (4 सप्ताह और 6) के साथ कम हुई । हालांकि, बाद में समय अंक, एक ही प्राप्तकर्ता में टेम डिब्बे के मूल्यांकन माइलॉयड पंजाब में घूम रहा है और RBPJKO चूहों की तिल्ली में स्थानीयकृत कोशिकाओं की संख्या में लगातार वृद्धि दिखाई, कोशिकाओं का एक बढ़ा उत्पादन का संकेत संचलन में बीएम से । Lys-GFP कोशिकाओं का विश्लेषण 6 सप्ताह में प्रत्यारोपण चूहों के बीएम में स्थानीयकरण से पता चला कि माइलॉयड कोशिकाओं को आगे नियंत्रण में से RBPJKO microenvironment में vasculature से रह रहे थे ।

सामूहिक रूप से, इन विशिष्ट पशु मॉडलों के साथ IVFM के संयोजन RBPJKO बीएम microenvironment में माइलॉयड कोशिकाओं की engraftment गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान की है । प्रयोगात्मक डिजाइन और मात्रात्मक दृष्टिकोण यहां वर्णित एक प्रतिमान है कि इसी तरह के सवालों के पते पर लागू किया जा सकता है के रूप में प्रस्तावित है । उदाहरण के लिए, अंय सेल विशिष्ट वंश ट्रैकिंग मॉडल का उपयोग करें, जैसे RAG1-GFP14 या Gata1-GFP15 चूहों, लसीकावत् या erythroid progenitors के व्यवहार के बाद, क्रमशः, बीएम में की अनुमति दे सकता है ।

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Protocol

सभी जानवरों के उपयोग को शामिल प्रक्रियाओं इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन के पशु देखभाल और उपयोग समिति के प्राधिकरण के साथ प्रदर्शन किया गया । जहां काम किया जाता है देश के पशु प्रयोग पर कानून का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें ।

1. Mx1CreRBPJ-/ प्राप्तकर्ता चूहों की तैयारी

  1. पार Mx1-Cre+ चूहों के साथ RBPJलोक्स/लोक्स चूहों10 को प्राप्त करने के लिए Mx1-Cre सकारात्मक RBPJलोक्स/लोक्स चूहों12 और Mx1-Cre नकारात्मक RBPJलोक्स/लोक्स littermates को कंट्रोल के रूप में इस्तेमाल करने के लिए. पीसीआर10द्वारा जीनोटाइप का सत्यापन करें ।
  2. 6-8 सप्ताह-पुराने Mx1Cre+/RBPJलोक्स/लोक्स और Mx1Cre-/RBPJलोक्स/लोक्स चूहों का प्रयोग polyI: C प्रेरणीय करने के लिए ।
  3. सुई polyI: सी २०० µ जी आईएफसआई Cre+ और Cre- चूहों में । एक polyI दे दो: सी इंजेक्शन 3 दिन पहले सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन । एक polyI दे दो: सी इंजेक्शन दूसरे हफ्ते, पिछले इंजेक्शन के 7 दिनों के बाद (कुल में चार इंजेक्शन) ।
    1. का प्रयोग करें RBPJKO (प्रेरित Mx1Cre+/RBPJलोक्स/) और RBPJWT (प्रेरित Mx1Cre-/RBPJलोक्स/लोक्स) प्राप्तकर्ताओं के रूप में 3 सप्ताह के अंतिम polyI: C इंजेक्शन के बाद चूहों ।
      नोट: यह pI द्वारा प्रेरित चूहों का उपयोग करने के लिए अनुशंसित है: इंजेक्शन के बाद पीसी 3 सप्ताह. IFNα प्रतिक्रिया polyI द्वारा ट्रिगर: सी बीएम में महत्वपूर्ण परिवर्तन लाती है, HSC के immunophenotypic विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप और परिधीय रक्त16में परिपक्व progenitors के उत्पादन में कमी आई है,17. टेम उपसमुच्चय का प्रतिनिधित्व इंजेक्शन के बाद 3 सप्ताह सामान्यीकृत है और चूहों सूजन के पाया प्रभाव के बिना उपयोग किया जा सकता है । इस प्रेरण प्रोटोकॉल RBPJ के लिए अनुकूलित किया गया है । यदि एक अलग जीन को हटाने, प्रेरण प्रोटोकॉल का निर्माण के आधार पर भिंन हो सकते हैं, और विलोपन मांय किया जाना चाहिए । हम एक कुल चार polyI: सी इंजेक्शन के बाद आर टी-पीसीआर द्वारा loxP साइटों के बीच RBPJ क्षेत्र की ~ १००% हटाने की पुष्टि की ।

2. Lys की तैयारी-EGFP दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं प्रत्यारोपण के लिए

  1. Euthanize one Lys-EGFP माउस (कार्बन डाइऑक्साइड के बाद गर्भाशय ग्रीवा) प्रत्यारोपण से पहले 1 या 2 ज ।
  2. ७०% इथेनॉल के साथ पशु शरीर की सतह स्प्रे ।
  3. एक त्वचा टखने के चारों ओर दोनों पैरों पर चीरा और शल्य संदंश के साथ दूर त्वचा और फर एक साथ साफ मांसपेशियों के ऊतकों को बेनकाब करने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें ।
  4. संभव के रूप में पैरों से ज्यादा मांसपेशियों को हटाने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें । एक कैंची का प्रयोग, हड्डियों में कटौती (घुटने और टखने संयुक्त) और femurs और tibias से किसी भी शेष मांसपेशी ऊतक साफ धुंध स्पंज का उपयोग कर । हड्डियों (दो femurs और दो tibias) को 6-वेल प्लेट में रखें जिसमें DMEM 10% FBS हो ।
  5. 10 मिलीलीटर ठंड 2mM EDTA पंजाबियों के साथ एक मोर्टार में हड्डियों को कुचलने और एकल सेल निलंबन में कोशिकाओं को लाने के लिए अस्थि मज्जा कोशिकाओं प्लास्टिक । वैकल्पिक रूप से, 2 मिमी EDTA पंजाबियों के साथ हड्डियों फ्लश एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ प्रत्येक पक्ष से 3 बार ।
  6. एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में एक ७०-µm फिल्टर का उपयोग करके अस्थि मज्जा कोशिकाओं को फ़िल्टर । पंजाब के 2-3 मिलीलीटर के साथ कुल्ला फिल्टर । ४६० x g पर 10 मिनट नीचे कोशिकाओं स्पिन, ताजा DMEM 10% FBS के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
  7. एक hemocytometer पर अस्थि मज्जा कोशिकाओं गिनती और सीरम के बिना IMDM में १.५ x 107 कोशिकाओं/एमएल को एकाग्रता समायोजित करें । २०० µ एल की मात्रा के साथ प्रति पशु 3 एक्स 106 कोशिकाओं का उपयोग करें कुल बीएम के बारे में 1/3 कोशिकाओं माइलॉयड GFP + कोशिकाओं रहे हैं । इंजेक्शन के लिए तैयार जब तक बर्फ पर कोशिकाओं को छोड़ दें । FACS9द्वारा GFP अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए ०.५ x 105 कक्षों का उपयोग करें ।

3. RBPJKO चूहों में Lys-GFP कोशिकाओं की अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण

  1. एक पाई पिंजरे में प्राप्तकर्ता चूहों को नियंत्रित । विकीर्ण चूहों एक सीएस १३७ irradiator पर गामा विकिरण (१,२०० राड) की एक घातक खुराक के साथ । एक विभाजन खुराक प्रोटोकॉल का उपयोग करें: ९०० राड शाम को ३०० के बाद राड अगली सुबह (16 एच के अलावा) ।
  2. विकिरण की दूसरी खुराक के बाद घातक विकिरणित RBPJWT और RBPJKO प्राप्तकर्ता चूहों 5-6 ज प्रत्यारोपण । पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से पशु प्रति 3 x 106 कोशिकाओं की एकाग्रता पर Lys-EGFP चूहों से काटा बीएम कोशिकाओं सुई (खंड 2 में फसल की कोशिकाओं के लिए विवरण देखें) ।
  3. अलग समय अंक पर IVFM द्वारा प्रत्यारोपित चूहों की छवि स्वतंत्र साथियों: 24 एच, और सप्ताह 2, 4 और 6 में, नीचे वर्णित के रूप में (देखें अनुभाग 4 & 5 के लिए vivo इमेजिंग प्रक्रिया में ) ।

4. Intravital इमेजिंग के लिए सर्जिकल तैयारी

  1. सर्जिकल उपकरणों निष्फल । दो महीन संदंश (एक सीधे, एक angled), ठीक कैंची और सुई धारकों की एक जोड़ी की एक जोड़ी । प्रक्रिया के लिए आवश्यक सभी आपूर्ति के साथ ऑपरेटिव क्षेत्र तैयार करें ।
  2. माउस दे ketamine कॉकटेल संवेदनाहारी का आईपी इंजेक्शन (Xylazine 2.5-5 मिलीग्राम/kg + acepromazine 1.0-2.5 मिलीग्राम/kg + ketamine 90-100 मिलीग्राम/एक 26-28 ग्राम सुई सिरिंज का उपयोग कर ।  पशु प्रक्रिया के दौरान हर 15 मिनट पर नजर रखी जाएगी और संवेदनाहारी मूल खुराक के ¼ पर आवश्यक के रूप में पूरक किया जाएगा.
  3. एक उचित गर्मी स्रोत पर माउस प्लेस (३७ ° c हीटिंग पैड, पशु हीटिंग पैड के साथ सीधे संपर्क से सुरक्षित) और नेत्रहीन श्वसन दर की निगरानी ।
  4. पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया का उपयोग कर सजगता की जाँच करें. पशु पूरी तरह से किसी भी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की शुरुआत से पहले संज्ञाहरण के तहत है कि यह सुनिश्चित करें ।
  5. एक 26-28 गेज सुई सिरिंज का उपयोग चूहों एक फ्लोरोसेंट संवहनी मार्कर के एक पूंछ नस इंजेक्शन (Dextran, १०० μL की 20 मिलीग्राम/
  6. दोनों आंखों के लिए पशु चिकित्सक आंख मरहम लागू करें । छोटे बिजली कतरनी के साथ जानवर के सिर की पृष्ठीय सतह क्लिप । एक बाल निकालना क्रीम के लिए लागू करें 5 min. का प्रयोग करें धुंध स्पंज क्रीम को हटाने के लिए और फिर खारा के साथ कुल्ला । तैयारी ७०% एक कपास झाड़ू का उपयोग कर शराब के साथ साफ खोपड़ी ।
  7. ठीक संदंश और कैंची का उपयोग करने के लिए एक छोटे midline त्वचा चीरा (10-20 mm) खोपड़ी पर अंतर्निहित पृष्ठीय खोपड़ी की सतह को बेनकाब करने के लिए । उपयोग 5-0 सर्जिकल सिल्क चीरा के प्रत्येक पक्ष पर त्वचा में दो रहने टांके जगह, इमेजिंग के लिए calvarium को बेनकाब करने के लिए एक प्रालंब बनाने.
  8. उनकी पीठ पर चूहों की स्थिति और एक गिलास नीचे माइक्रोस्कोप तेल से भरा पकवान में उजागर खोपड़ी जलमग्न । mutiphoton इमेजिंग कमरे में पशु परिवहन ।
  9. उद्देश्य के ऊपर कांच पकवान पर तैनात calvarium के साथ माइक्रोस्कोप मंच पर पशु प्लेस और फिर एक ३७ ° c हीटिंग पैड के साथ कवर (पशु गर्मी के साथ सीधे संपर्क से संरक्षित किया जाना चाहिए) ।

5. Vivo में माउस Calvarium के उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

  1. multiphoton इमेजिंग के लिए संशोधित एक औंधा फोकल सिस्टम का उपयोग करें ( सामग्री तालिकादेखें) । निर्माता के निर्देशों के बाद एक 2-फोटॉन लेजर ८३० एनएम के लिए ट्यून, माइक्रोस्कोप नाक टुकड़ा में एक 20X डब्ल्यू, एनए ०.९५ उद्देश्य लेंस जगह और लेजर बीम संरेखण की जांच करें ।
    नोट: ईमानदार माइक्रोस्कोप सिस्टम सबसे अधिक इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, लेकिन एक औंधा multiphoton प्रणाली भी उपयोग किया जा सकता है. इस अध् ययन में एक कस् टम डिजायन atraumatic stereotaxic डिवाइस का इस् तेमाल किया गया । हालांकि वहाँ कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereotaxic उपकरणों के लिए ईमानदार खुर्दबीन सिस्टम, वहाँ माउस खोपड़ी हासिल करने के उद्देश्य से एक औंधा माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereotaxic डिवाइस है. एक कस्टम stereotaxic डिवाइस के लिए विकल्प के रूप में, खोपड़ी स्थिरता के लिए विभिन्न टेप या गोंद तरीकों का उपयोग उद्देश्य से ऊपर की स्थिति में सुरक्षित किया जा सकता है ।
  2. एक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें । एक दिशात्मक स्कैनिंग मोड चुना जाता है अगर "अधिग्रहण सेटिंग्स" पैनल की जाँच करें. 4 μs/पिक्सेल, फ़्रेम दर को ५१२ x ५१२ पिक्सेल तक स्कैन करने और १.५ पर ज़ूम करने की गति सेट करें । चुनें 20X W Na ०.९५ उपलब्ध उद्देश्य लेंस की सूची से उद्देश्य nosepiece में तैनात लेंस मैच ।
  3. "छवि अधिग्रहण नियंत्रण" पैनल से "डाई सूची" का उपयोग और "दो फोटॉन" का चयन करें. "लाइट पथ और रंजक" विंडो खोलें और DM690-980 उत्तेजना डीएम का चयन करें । लेजर यूनिट 2 में चेक बॉक्स की जांच करके 2P लेजर शटर खोलें । "माइक्रोस्कोप नियंत्रक" विंडो में, RDM690 दर्पण का चयन करें ।
  4. चुनें "महामारी लैंप", B/जी महामारी-फ़िल्टर घन चुनें और नमूना पर उद्देश्य ध्यान नाड़ी प्रवाह और calvarium अस्थि मज्जा आला कल्पना, केंद्रीय नस (ए) और कोरोनरी सीवन (बी) (चित्रा 2a) के विभाजन संदर्भ के रूप में उपयोग कर ।
  5. गैर स्कैन मोड का उपयोग कर छवियों को इकट्ठा. तीन बाहरी डिटेक्टरों का चयन करें: पीएमटी detector1 कोलेजन (उत्सर्जन फिल्टर-430/100 एनएम) के स्वसहायता संकेत इकट्ठा करने के लिए, GaAsP detector2 GFP संकेत (उत्सर्जन फिल्टर-525/50) और GaAsP detector3 TRITC-dextran (उत्सर्जन फिल्टर-605/90 एनएम) के संकेत एकत्र करने के लिए इकट्ठा करने के लिए ।
    1. phototoxicity को कम करने के लिए कोई औसत के साथ 4μs/पिक्सेल की स्कैन दर पर इमेजिंग निष्पादित करें । एक निरंतर लेजर शक्ति और डिटेक्टर लाभ के लिए न्यूनतम संतृप्ति के साथ डिटेक्टर की पूर्ण गतिशील रेंज का उपयोग करने के लिए समायोजित पर छवियों को इकट्ठा ।
    2. calvarium अस्थि मज्जा के 6 क्षेत्रों से ऊतक (६० x 1 माइक्रोन जेड-पोट) की गहराई के माध्यम से वर्गों की श्रृंखला ले लीजिए । 1 माइक्रोन, ज़ूम १.५ और ५१२ x ५१२ पिक्सेल फ़्रेम आकार (४२३ µm x ४२३ µm) के चरण आकार सेटिंग का उपयोग करें ।
      नोट: समग्र कुल समय की छवि के लिए आवश्यक एक माउस 1-1.5 एच है ।

6. मात्रात्मक विश्लेषण

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक समर्पित 3 डी/4d छवि quantitation और दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि quantitation और 3 डी पुनर्निर्माण प्रदर्शन ( सामग्री तालिकादेखें). 3 डी का उपयोग अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (मिप), अल्फा-ब्लेंड या छाया प्रक्षेपण की मात्रा प्रतिपादन एल्गोरिदम में सक्रिय रूप से जेड-ढेर कल्पना ।
  2. "स्पॉट ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन मॉड्यूल"का उपयोग करके सेगमेंट GFP कक्ष । GFP कोशिकाओं की झूठी सकारात्मक गिनती को खत्म करने के लिए स्टैक अंकगणित प्रोसेसिंग (चैनल घटाव) लागू करें (यह हरे और लाल चैनलों में मजबूत प्रतिदीप्ति को प्रदर्शित करने वाले अस्थि कोशिकाओं के सिग्नल को समाप्त करता है) ।
  3. vasculature और सतह विभाजन मॉड्यूल का उपयोग कर हड्डी की सतह के विभाजन प्रदर्शन । यदि आवश्यक हो, तो ऊपर की सतह से किसी के लिए कोशिकाओं की दूरी की गणना X-तनाव एल्गोरिदम कहा जाता है "स्थान की दूरी के लिए भूतल" लागू करने से ।

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Representative Results

2 RBPJKO के साथियों और 2 RBPJWT प्राप्तकर्ताओं अलग समय अंक पर एक व्यक्तिगत इमेजिंग सत्र में imaged थे: बीएम Lys-GFP कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के बाद 24 एच और 2, 4 और 6 सप्ताह (कार्यप्रवाह चित्र 1aमें सचित्र है) ।

प्रत्येक माउस में, छवियों के 6 मानक क्षेत्रों से प्राप्त किए गए बीएम calvarium, केंद्रीय नस (चित्रा 2a, एक) और कोरोनरी सीवन (चित्रा 2a, बी) के विभाजन के संबंध में उनकी स्थिति की पहचान की । Dextran टेक्सास के इंजेक्शन लाल इमेजिंग से पहले इन स्थलों की पहचान और 6 क्षेत्रों के चयन की अनुमति देता है (चित्र 2a): ऊपरी बाएँ, मध्यम और दाएँ (उल, उम, उ०), और निचले बाएँ, मध्यम और दाएँ (LL, LM, LR). ६० x 1 माइक्रोन जेड-स्टैक प्रत्येक क्षेत्र से एकत्र किए जाते हैं और 3-डी अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (मिप), (चित्र 2 बी) के रूप में रेंडर किया जाता है; 3-डी छाया प्रक्षेपण, जो हड्डी घटक (ग्रे) दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (स्वसहायता) माइक्रोस्कोपी की जांच कोलेजन संगठन द्वारा उत्पन्न शामिल (चित्रा 2c); और अंत में, एक 3-डी खंड छवि है, जो कोशिकाओं और हड्डी और जहाजों से उनकी दूरी की माप के quantitation की अनुमति देता है (चित्रा 2d).

क्योंकि प्रत्यारोपण के बाद बीएम calvarium के विभिंन क्षेत्रों में टेम कोशिकाओं के डाक वरीयताओं में संभावित मतभेदों के कारण, यह एक माउस के calvarium में कई क्षेत्रों नमूना महत्वपूर्ण है । चित्रा 3 6 क्षेत्रों में सेल वितरण का एक उदाहरण से पता चलता है 2 सप्ताह में एक RBPJWT और एक RBPJKO प्राप्तकर्ता में विश्लेषण के बाद BMT (हरी माइलॉयड कोशिकाओं, ग्रे हड्डी) छाया प्रक्षेपण 3d प्रतिपादन एल्गोरिथ्म का उपयोग कर । प्रति क्षेत्र कक्षों की संख्या RBPJWT माउस में ६४ से २५८ तक और RBPJKO माउस में २६५ से ५७३ तक की श्रेणी में है । अंतिम परिणाम तो 6 विश्लेषण क्षेत्रों की औसत संख्या के रूप में व्यक्त कर रहे हैं: क्षेत्र प्रति कोशिकाओं की संख्या/प्रति माउस (औसत १३५ RBPJWT बनाम RBPJKO में ४६९) । यह प्रतिनिधि प्रयोग इंगित करता है कि RBPJKO प्राप्तकर्ता की तुलना में RBPJWT में प्रति क्षेत्र कक्ष वितरण में एक बड़ा भिंनता है । इसके अलावा, एक माउस, जो आम है के भीतर calvarium क्षेत्रों में पाया भिंनता के अतिरिक्त, वहां एक ही समूह के भीतर व्यक्तिगत चूहों के बीच बदलाव कर रहे हैं । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि हर समय बिंदु के लिए कम 4 चूहों प्रति प्रयोग मूल्यांकन कर रहे है एक कुल 24 से 30 क्षेत्रों की एक ंयूनतम प्राप्त करने के लिए शर्त प्रति विश्लेषण किया जाएगा ।

चित्रा 4 एक पायदान दोषपूर्ण बीएम microenvironment में माइलॉयड जनक विस्तार की गतिशीलता से पता चलता है प्रत्यारोपण के बाद 6 सप्ताह से अधिक नियंत्रण की तुलना में । इस प्रतिनिधि प्रयोग में 8 RBPJWT और 8 RBPJKO चूहों का प्रत्यारोपण किया गया और प्रत्येक समय बिंदु पर (2 RBPJWT चूहों और 2 RBPJKO चूहों) संकेत दिया समय बिंदुओं पर छवि । चित्रा 4a एक प्रतिनिधि 3 से पता चलता है 1 के पुनर्निर्माण 6 क्षेत्र से बाहर का अधिग्रहण किया । प्रत्येक 6 क्षेत्रों में कक्षों की गणना की गई और प्रत्येक समय बिंदु (कुल 12 क्षेत्रों) में दो चूहों के कक्षों/क्षेत्र की औसत संख्या RBPJWT और RBPJKO प्राप्तकर्ताओं (आरेख 4c) के लिए परिकलित की गई थी । यह विश्लेषण इंगित करता है कि: (i) दाता Lys-GFP कोशिकाओं RBPJWT और RBPJKO प्राप्तकर्ताओं में एक समान डाक दक्षता है; ii) RBPJKO प्राप्तकर्ताओं में कक्ष अधिक तेज़ी से विस्तृत होते है और BMT के बाद सप्ताह 2 में RBPJWT प्राप्तकर्ताओं में कक्षों की संख्या दुगुनी होती है; iii) RBPJWT प्राप्तकर्ताओं में कक्ष बाद में विस्तृत होते है और BMT के बाद सप्ताह 4 में RBPJKO प्राप्तकर्ताओं में कक्षों की तुलना में 2-गुना अधिक होते हैं; और iv) दोनों RBPJWT और RBPJKO प्राप्तकर्ताओं में कक्ष संख्या BMT के बाद सप्ताह में 6 समान हो जाते हैं । पंजाब में दाता माइलॉयड कोशिकाओं का विश्लेषण 4 सप्ताह में RBPJWT प्राप्तकर्ताओं के बीएम से की तुलना में RBPJKO प्राप्तकर्ताओं के बीएम से माइलॉयड कोशिकाओं का एक उच्च उत्पादन इंगित करता है, उस समय जब RBPJKO चूहों के बीएम Lys-GFP कोशिकाओं की एक कम सामग्री दिखाई दिया । बी एम और माइलॉयड कोशिकाओं पंजाब में घूम के में निवासी माइलॉयड कोशिकाओं के संयुक्त विश्लेषण, संकेत मिलता है कि RBPJKO में बीएम microenvironment Lys-GFP कोशिकाओं का विस्तार और अधिक तेजी से जुटाने के लिए तैयार हैं । लंबी हड्डियों में Lys-GFP कोशिकाओं के समानांतर FACS विश्लेषण एक ही चूहों से बीएम IVFM द्वारा मनाया एक के समान एक प्रवृत्ति दिखाई; हालांकि, शर्तों के बीच अंतर कम स्पष्ट (चित्र 4B) थे ।

हड्डी या vasculature से व्यक्तिगत Lys-GFP कोशिकाओं की दूरी का मापन चित्रा 5में दिखाया गया है । इस प्रतिनिधि अध्ययन में, BMT से 6 सप्ताह में RBPJWT और RBPJKO calvarium के एलएम क्षेत्र का 3-डी फॉल्ट विश्लेषण (चित्र 5/) का उपयोग किया गया था । हड्डी से दूरी और जहाजों क्षेत्र में प्रत्येक कोशिका के लिए गणना की गई: २०० RBPJWT में कोशिकाओं और RBPJKO में २५५ कोशिकाओं, और इस तरह, एक औसत के रूप में व्यक्त की । विश्लेषण से पता चलता है कि Lys-GFP कोशिकाओं RBPJWT और RBPJKO चूहों में हड्डी से एक समान दूरी पर स्थानीयकरण (11 माइक्रोन), लेकिन है कि वे vasculature चूहों की तुलना में RBPJKO चूहों में RBPJWT से अधिक दूर रहते हैं (15 माइक्रोन बनाम 5 माइक्रोन, क्रमशः). यह परिणाम पेचीदा है, के रूप में RBPJKO चूहों में Lys-GFP कोशिकाओं संचलन में अधिक RBJWT चूहों की तुलना में जुटाए, और इस प्रकार जहाजों के करीब स्थानीयकरण की उम्मीद होगी. हालांकि, यह संभव है कि स्थानीयकरण में अंतर इन दो आबादियों (RBPJWT और RBPJKO में), एक बिंदु है कि इस विश्लेषण के द्वारा संबोधित नहीं किया जा सकता के भेदभाव का एक अलग स्तर को दर्शाता है । इस परिणाम के महत्व के बाद किया जाएगा सभी 6 क्षेत्रों में कोशिकाओं का एक बड़ा पूल के साथ और FACS विश्लेषण के संयोजन से ।

कुल मिलाकर, इष्टतम परिणाम प्राप्त कर रहे है जब क्षेत्रों की एक छोटी संख्या के प्रति माउस का विश्लेषण कर रहे हैं । इमेजिंग BMT के बाद प्रारंभिक समय बिंदुओं पर विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है, घातक विकिरण क्षति के रूप में vasculature और केशिकाओं से dextran के रिसाव छवि परिभाषा को कम कर देता है । इस प्रकार यह जरूरी है कि बड़ी संख्या में पुनरावृत्ति हो, विशेष रूप से जल्द समय बिंदुओं पर.

स्वसहायता समूहों 3 डी में कोलेजन फाइबर संगठन की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण है । यह एक दूसरे क्रम रैखिक ऑप्टिकल प्रक्रिया है जो ऐसे कोलेजन फाइबर गैर centrosymmetry और एक उच्च दूसरे क्रम रैखिक गुणांक के रूप में संरचनाओं से उत्पंन होता है । जब तीव्र घटना प्रकाश ऐसी संरचनाओं के साथ सूचना का आदान प्रदान, यह दो बार घटना आवृत्ति या आधा घटना तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश उत्पंन करता है । इसलिए, कोई लेबलिंग 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के दौरान स्वसहायता संकेत पर कब्जा करने के क्रम में की जरूरत है । ८३० एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ, हम उत्सर्जन फ़िल्टर 430/100 एनएम के साथ ब्लू चैनल में एसएचजी संकेत पर कब्जा ।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक कार्यप्रवाह. (क) Mx1-Cre/RBPJलोक्स/लोक्स चूहों के RBPJKO और RBPJWT चूहों को उत्पन्न करने के लिए ~ 4 सप्ताह पूर्व इमेजिंग की प्रेरण; (ख) Lys-GFP ट्रांसजेनिक चूहों से बीएम कोशिकाओं की तैयारी; (ग) बीएम Lys की ट्रांसप्लांटेशन-GFP कोशिकाओं को घातक रूप से विकिरणित RBPJKO या RBPJWT प्राप्तकर्ताओं में; (D) 24 ज, 2, 4 और 6 सप् ताह में माउस calvarium के IVFM के बाद BMT, इच्छामृत्यु और बीएम एनालिसिस द्वारा FACS के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: बीएम संवहनी आला की IVFM । (A) मोज़ेक बहु-फोटॉन छवि Lys-EGFP माउस calvarium के 6 मानक क्षेत्रों में दिखा इमेजिंग (UL: ऊपरी बाएँ, उम: ऊपरी मध्य, उ०: ऊपरी दाएँ, LL: लोअर बाएँ, एल एम: लोअर मिडिल, एलआर: लोअर राइट) (हरे, माइलॉयड कोशिकाओं; लाल, vasculature; ग्रे, हड्डी) 10x आवर्धन; (बी-डी) बीएम आला विस्तार के रूप में गाया: (ख) मिप, (ग) 3-डी छाया प्रक्षेपण, (D) 3-डी फॉल्ट छवि । छवियां संसाधित-एक समर्पित 3 डी/4d छवि quantitation और दृश्य सॉफ्टवेयर (तालिका 1) का उपयोग कर रहे थे । स्केल बार्स = ५० माइक्रोन बी, सी, डी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: माइलॉयड सेल 2 सप्ताह में Engraftment । Lys की छवियां-GFP कोशिकाओं (हरा) और अस्थि सतह (ग्रे) 6 बीएम क्षेत्रों में एक RBPJWT और एक RBPJKO माउस की calvarium की हड्डी से (यू: ऊपरी, एल: वाम, एम: मध्य, आर: सही) । स्केल बार्स = ५० माइक्रोन । बार रेखांकन (दाएं) प्रत्येक क्षेत्र में गिना सेल की संख्या (RBPJWT रेंज 64-258; RBPJKO रेंज 265-573) और उनकी औसत संख्या १३५ एसटीडी +/-73, और ४६९ एसटीडी +/-१२१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: माइलॉयड कोशिकाओं की कैनेटीक्स Engraftment और उत्पादन के बाद BMT. (क) Lys-GFP कोशिकाओं की छवियाँ (हरा) और अस्थि सतह (ग्रे) एक प्रतिनिधि क्षेत्र में एक RBPJWT और RBPJKO माउस के calvarium से प्रत्येक समय अंक में संकेत दिया. स्केल बार्स = ५० माइक्रोन; (ख) डॉट ब्लाटर एक ही माउस से लंबी हड्डियों काटा की बीएम के भीतर प्रवाह cytometry द्वारा Lys-GFP सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाने vivo (ऊपर) में imaged । (C) बार रेखांकन प्रत्येक समय बिंदु पर 2 चूहों (कुल 12 क्षेत्रों) में कक्षों/क्षेत्र की औसत संख्या दर्शाते हैं, +/-एसटीडी. (घ) लाइन ग्राफ न्यूट्रोफिल की कुल संख्या में गुना वृद्धि दिखाता है (सेल काउंटर द्वारा गणना) एक ही चूहों के पंजाब में प्रस्तुत में से (क) इंगित समय बिंदुओं पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: हड्डी और Vasculature के लिए बीएम रिश्तेदार में माइलॉयड कोशिकाओं का स्थानीयकरण । (क) प्रतिनिधि 3-डी Lys-GFP कोशिकाओं और vasculature, और Lys-GFP कोशिकाओं और हड्डी calvarium और RBPJWT प्राप्तकर्ताओं RBPJKO से 6 सप्ताह में BMT की हड्डी के एक ही क्षेत्र में खंड की छवियों । स्केल बार्स = ५० माइक्रोन । (B) बार ग्राफ़ अस्थि सतह या vasculature से Lys-GFP कोशिकाओं की माइक्रोन +/-SEM में औसत दूरी को सारांशित करता है । में मापा कक्षों की संख्या: RBPJWT n = २०० कक्षों और RBPJKO n = २५५ कक्ष । vasculature से Lys-GFP कोशिकाओं की दूरी RBPJWT चूहों की तुलना में RBPJKO में अधिक है, p < 0.001 (Student ' s t-test). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल Intravital फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा engraftment टेम कोशिकाओं के कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित एक प्रयोगात्मक डिजाइन का वर्णन करता है । इस अध्ययन में, एक WT बीएम में माइलॉयड जनक कोशिकाओं के विस्तार या दोषपूर्ण बीएम संकेत एक पायदान में GFP या BMT प्राप्तकर्ताओं में RBPJWT के बाद Lys-RBPJKO सकारात्मक माइलॉयड कोशिकाओं का पालन करके अस्थि calvarium में ट्रैक किया गया था । इस दृष्टिकोण एक मॉडल है कि इसी तरह के सवालों के समाधान के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में प्रस्तावित है, उदाहरण के लिए: i) के लिए अंय वंश की कोशिकाओं के बीएम niches में विस्तार और स्थानीयकरण का निर्धारण, ऐसे लसीकावत्, erythroid या megakaryocytic कोशिकाओं के रूप में, दाता कोशिकाओं के रूप में उपयोग करके टेम कोशिकाओं GFP या टमाटर-लाल चला वंश विशिष्ट प्रवर्तकों ले जाने; ii) प्राप्तकर्ताओं के रूप में अंय विशिष्ट KO या ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके विभिंन सूक्ष्म पर्यावरणीय निर्धारकों का मूल्यांकन करना ।

calvarium हड्डी में इस इमेजिंग प्रोटोकॉल की ताकत, यह है कि शारीरिक स्थलों बीएम क्षेत्रों, केंद्रीय नस और कोरोनरी सीवन के विभाजन का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया, यथोचित सभी चूहों में संरक्षित कर रहे हैं, व्यक्तिगत के बीच निरंतरता की अनुमति प्रयोग एक स्वचालित मंच की आवश्यकता forgoing करते हुए । इसके अलावा, GFP मॉडल का उपयोग टेम कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए बहुत प्रभावी साबित हुआ, के रूप में GFP के बाद विकिरण के रूप में, इष्टतम परिस्थितियों में एक स्थिर संकेत प्रदान की है । अंत में, इमेजिंग सेट अप वर्णित है, एक औंधा माइक्रोस्कोप और एक स्वनिर्धारित stereotaxic डिवाइस जिसमें माउस लापरवाह स्थिति में है का उपयोग कर, बहुत श्वास कलाकृतियों को कम करने.

इस प्रायोगिक डिजाइन के दो पहलुओं, अगर लागू, calvarium के IVFM का एक व्यापक और अधिक प्रभावी उपयोग करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । सबसे पहले, यह अनुकूलन और अनुदैर्ध्य इमेजिंग के प्रोटोकॉल मानकीकरण अलग समय अंक में एक ही माउस के प्रेक्षण (2 दिन से कई हफ्तों के लिए) हस्तक्षेप के बाद (यानी BMT या चिकित्सा) के बजाय का उपयोग करने की अनुमति महत्वपूर्ण हो जाएगा चूहों के स्वतंत्र साथियों । के रूप में इस दृष्टिकोण के बाद शल्य चिकित्सा वसूली और उपायों के उपयोग के लिए उपयुक्त शर्तों की आवश्यकता है सूजन, संक्रमण प्रतिक्रिया, और इमेजिंग के स्थल पर निशान गठन, अपने आवेदन वर्तमान में सीमित है । दूसरा, यह वंश ट्रैकिंग माउस बीएम आला के विशिष्ट कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन ले मॉडल की एक सरणी विकसित करने के लिए मूल्यवान होगा (संवहनी, endosteal, perivascular और न्यूरॉन) विशिष्ट के साथ टेम सेल कार्यों गठबंधन करने के लिए बीएम niches के लक्षण ।

हड्डी की इमेजिंग अभी भी कुछ चुनौतियों और अंय ऊतकों की तुलना में सीमाएं हैं । हालांकि दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के ऊतकों में 100-1000 माइक्रोन गहरी घुसना कर सकते हैं, यह अभी भी calvarium हड्डी की पूरी मोटाई के माध्यम से छवि के लिए चुनौतीपूर्ण है । छवियां बढ़ती गहराई के साथ गुणवत्ता खो तो यहां प्रोटोकॉल ६० माइक्रोन मोटी ढेर से बीएम क्षेत्रों के विश्वसनीय विश्लेषण का वर्णन है । एक और पहलू है कि विसंगति या इष्टतम इमेजिंग में परिणाम कर सकते है calvarium हड्डी की घुमावदार आकार है, जो छवि को ध्यान से बाहर ला सकते हैं । यह खोपड़ी उद्देश्य के ऊपर कांच पकवान पर पूरी तरह से तैनात है, संभवतः एक stereotaxic डिवाइस के साथ महत्वपूर्ण है । वास्तव में, खोपड़ी का आकार महत्वपूर्ण है: चूहों की खोपड़ी भी युवा या बहुत छोटे एक दिया stereotaxic डिवाइस में पूरी तरह फिट नहीं हो सकता है. एक उदाहरण के रूप में, यहां का उपयोग किया डिवाइस 6 सप्ताह से छोटी और 20 से कम जी चूहों फिट नहीं है

एक अतिरिक्त सीमा है कि इमेजिंग इस अध्ययन में उपयोग प्रणाली 3 चैनलों तक ही सीमित है । के रूप में नीले चैनल स्वचालित रूप से गैर इकट्ठा करने के लिए सौंपा है लेबलिंग अस्थि कोलेजन के आधारित स्वसहायता संकेत, केवल 2 चैनल विशिष्ट प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए उपलब्ध हैं । इसके अलावा, इस प्रणाली के एक गति सीमा है 2 μs/पिक्सेल समय और ५१२ x ५१२ पिक्सल फ्रेम आकार है, जो तेजी से गतिशील प्रक्रियाओं (जैसे रक्त प्रवाह और कोशिका जुड़ाव के मूल्यांकन के रूप में रक्त प्रवाह के उपाय के रूप में) के लिए आदर्श नहीं है पर 1 फ्रेम/।

एक महत्वपूर्ण चुनौती यह है कि विकिरण BMT vasculature की अखंडता समझौता के लिए प्रदर्शन किया । विकिरण के बाद बीएम में मौजूद संवहनी रिसाव विभाजन के साथ कठिनाइयों का कारण बनता है/व्यक्तिगत संरचनाओं के quantitation, जो मात्रात्मक विश्लेषण में कठिनाई पैदा कर सकता है ।

अंत में, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि एक माउस के इमेजिंग लगभग 1 एच लेता है, और चूहों की संख्या है कि एक निश्चित दिन में imaged किया जा सकता है (~ 4 से 6 चूहों) सीमित है । इस प्रकार, विश्लेषण की शक्ति प्राप्त करने के लिए नमूना आकार में वृद्धि एकाधिक स्वतंत्र प्रयोगों की आवश्यकता हो सकती है, जो परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल के बाद, BMT से 24 ज के बाद बीएम में IVFM द्वारा पता लगाया टेम कोशिकाओं Lys-GFP+ कोशिकाओं की संख्या ~ 30 कोशिकाओं/क्षेत्र है और यह कोशिकाओं के प्रारंभिक इनपुट (3 x 106) की तुलना में काफी एक छोटी संख्या है । हालांकि, इस समस्या का हिस्सा बीएम निम्नलिखित i.v. इंजेक्शन के लिए डाक से पहले फेफड़ों और जिगर में फँसाना सेल के कारण है, यह पता लगाया जा करने के लिए है कि क्या वहाँ चयनित लोगों के अलावा अन्य calvarium में क्षेत्रों रहे हैं, जहां उच्च पर प्रत्यारोपित कोशिकाओं घर दक्षता.

डाक और engraftment के बाद बीएम में कोशिकाओं की BMT सामांयतः सीडी 45.1 की माप द्वारा प्रवाह cytometry द्वारा पीछा कर रहे है/सीडी 45.2 मार्करों, GFP, Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) या वंश और स्टेम सेल मार्कर के संयोजन । IVFM का उपयोग, विशेष रूप से जल्दी समय बिंदुओं पर, उपलब्ध अद्वितीय और अतिरिक्त जानकारी है कि प्रवाह cytometry द्वारा प्रदान नहीं किया जा सकता है बनाता है । उदाहरण के लिए, अक्सर यह आसान नहीं है FACS घटनाओं है कि घटनाओं से "कोशिकाओं" कर रहे है "कलाकृतियों", विशेष रूप से जब सकारात्मक घटनाओं की एक कम संख्या में एकत्र की है (यानी 24 पर BMT से एच) । IVFM इस अंतर को एड्स कि कोशिकाओं के आकृति विज्ञान और स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है । इसी प्रकार, बीएम टेम कोशिकाओं के FACS विश्लेषण निस्तब्धता या हड्डियों दुर्घटनाग्रस्त द्वारा काटा कोशिकाओं है कि आला और कोशिकाओं है कि संवहनी प्रणाली में संचलन में पहले से ही थे में रह रहे थे शामिल होंगे । दरअसल, IVFM अंतर और बीएम आला और कोशिकाओं है कि खून में जुटा रहे है भीतर आराम कर कोशिकाओं के मूल्यांकन परमिट । यह अंतर महान मूल्य का है जब एक दिया मॉडल में डाक, स्थानीयकरण, भेदभाव और जुड़ाव के कैनेटीक्स का अध्ययन । महत्वपूर्ण बात, IVFM एक विशिष्ट जगह का गठन microenvironment कोशिकाओं के सापेक्ष टेम कोशिकाओं की स्थिति पर अद्वितीय जानकारी प्रदान कर सकते हैं ।

अंय तरीकों के लिए बीएम आला की संरचना का पता इस्तेमाल किया, ऐसे ऊतकीय विश्लेषण किया गया है । फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा बीएम और ऊतकीय विश्लेषण की intravital माइक्रोस्कोपी के बीच तुलना अच्छी तरह से किया गया है और सुरुचिपूर्ण ढंग से लो सेलसो एट अल द्वारा चर्चा की । 18.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इमेजिंग इंडियाना विश्वविद्यालय में जैव माइक्रोस्कोपी के लिए इंडियाना केंद्र में किया गया था, डॉ केन डन द्वारा निर्देशित । stereotaxic डिवाइस एक प्रोटोटाइप डिजाइन और बाल चिकित्सा अनुसंधान के लिए मार्क Soonpaa, वेल्स केंद्र द्वारा बनाई गई है । यह काम NIH/R01DK097837-09 (नेकां), NIH/R01HL068256-05 (नेकां), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (नेकां), सीपीसीबी रिसर्च फाउंडेशन (नेकां) और CTSI सहयोगी परियोजना IUSM/Notre डेम (नेकां) द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine cocktail IU School of Medicine Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran Tdb Consultancy TD150-100mg Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer Braintree Scientific CLP-323 75
Gauze sponge Med Vet International PK224 4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream Commercial store
Saline Med Vet International RXSAL-POD1LT 0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe Fisher Scientific 14-826-79 28 g, 1/2 cc
Fine Forceps Fine Science Tools 00108-11, 00109-11 straight forcep, angled forcep
Scissor Fine Science Tools 15018-10
Needle holder Fine Science Tools 12002-14
5-0 silk suture Fisher Scientific MV-682 Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish WillCo GWSt-5040
Optical microscope oil Leica
Stereotaxic stage insert  IU School of Medicine Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system  Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective  Olympus
Small heating pad Commercial store Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software Bitplane 3/4 D Image Visualization and Analysis software

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References

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आनुवंशिक मॉडल के साथ Intravital फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (IVFM) का मेल अस्थि मज्जा niches के लिए टेम कोशिकाओं के Engraftment गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए
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Wang, L., Kamocka, M. M., Zollman, A., Carlesso, N. Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches. J. Vis. Exp. (121), e54253, doi:10.3791/54253 (2017).

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