Proponiamo un protocollo per la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Placcando le cellule del sangue trasdotte su piastre rivestite di matrice con centrifugazione, le iPSC vengono indotte con successo da cellule galleggianti. Questa tecnica suggerisce un protocollo di riprogrammazione semplice ed efficace per cellule come PBMC e CBMC.
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Articolo metodologico
Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il recente sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) ha dimostrato che le cellule somatiche mature possono tornare a una, stato pluripotente indifferenziata. Ora, riprogrammazione avviene con vari tipi di cellule somatiche adulte: cheratinociti, cellule urina, fibroblasti, ecc I primi esperimenti erano solitamente fatto con fibroblasti dermici. Tuttavia, questo richiede una procedura chirurgica invasiva per ottenere fibroblasti da pazienti. Pertanto, cellule in sospensione, come le cellule del sangue e delle urine, sono stati considerati ideali per la riprogrammazione causa della convenienza di ottenere le cellule primarie. Qui, riportiamo un protocollo efficace per la generazione di IPSC dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Con placcatura le PBMC trasdotte in serie ad un nuovo, piastra con centrifugazione a matrice rivestita, questo protocollo può fornire facilmente colonie IPSC. Questo metodo è applicabile anche per le cellule mononucleate del sangue del cordone ombelicale (CBMCs). Questo studio presenta un prot semplice ed efficienteOcol per la riprogrammazione di PBMC e CBMCs.
Introduzione
Le cellule staminali sono stati uno dei materiali più interessanti nella terapia clinica per gli ultimi decenni 1. Le proprietà interessanti di cellule staminali sono pluripotenza e la capacità di auto-rinnovarsi. Nel 1981, le prime cellule staminali embrionali (ESC) sono stati isolati dal embrione di topo 2. Tuttavia, quando la tecnica è stata applicata agli embrioni umani, ha affrontato diverse questioni etiche.
Nel 2006, quando il dottor Yamanaka e il suo team riprogrammate la prima cella pluripotenti da cellule somatiche del mouse, il campo delle cellule staminali ha riguadagnato la sua possibilità e l'intere....
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Protocollo
Etica Dichiarazione: Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Cattolica di Corea (KC12TISI0861).
1. Isolamento dei monociti cellule dal sangue
- L'isolamento di cellule monociti (Giorno -5)
- Ottenere almeno 10 ml di sangue fresco da un prelievo di sangue in un tubo preparato cellulare (CPT).
- Trasferire il sangue in una nuova provetta conica da 50 ml e diluire con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in un rapporto 1: 4.
NOTA: un più alto rapporto di diluizione può essere utilizzato per una maggiore purezza. - Aggiungere 10 ml di media gradiente di densità....
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Risultati
Questo protocollo presenta un metodo semplice per riprogrammare PBMC isolate da sangue. Utilizzando la combinazione di rivestimento di serie e centrifugazione, iPSCs sono stati generati con successo. Con questo metodo, iPSCs potrebbero essere generati con una piccola quantità di cellule di sangue intero senza isolare o espandere un tipo di cellula specifico. Abbiamo generato con successo iPSCs da solo 1x10 4 celle in una piccola piastra di coltura cellulare.
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Discussione
Dal momento che le cellule staminali embrionali (CSE) hanno evidenziato diverse lacune, è stato richiesto l'esigenza di uno strumento alternativo. Pertanto, lo sviluppo delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da Yamanaka è venuto sotto i riflettori internazionali. E 'stato quasi un decennio da quando Yamanaka ha scoperto che pluripotenza può essere indotta con l'aggiunta di soli quattro geni nelle cellule somatiche adulte. Dal momento che iPSCs sono "indotte" dalle cellule somatiche ma.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Programma di Ricerca Scientifica di Base attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF), finanziata dal Ministero della Scienza, delle TIC e della Pianificazione Futura (2013R1A1A1076125).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Plasticware | |||
| 100 mm Piatto | TPP | 93100 | |
| Piastra a 6 pozzetti | TPP | 92006 | |
| Provetta cornica da 50 ml | SPL | 50050 | |
| Provetta cornica da 15 ml | SPL | 50015 | |
| Pipetta monouso da 10 ml | Falcon | 7551 | |
| Pipetta monouso da 5 ml | Falcon | 7543 | |
| Piastra a 12 pozzetti | TPP | 92012 | |
| Piastra a 24 pozzetti | TPP | 92024 | |
| PBMC Materiali di isolamento | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Terreni cellulari del sangue |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Sangue Supplemento di terreni cellulari (100x) |
| iPSC Materiali per la generazione e la coltura | |||
| CytoTune-iPSC Kit di riprogrammazione Sendai | Life Technologies | A16518 | |
| Terreni TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | 5940 | terreni iPSC |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| Inibitore ROCK | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Soluzione |
| Controllo di qualità Materiali | |||
| 18 mm Vetro di copertura | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovazione | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Albumina sierica bovina | Laboratorio vettoriale | SP-5050 | |
| Anticorpo Anti-SSEA4 | Millipore MAB4304 | ||
| Anticorpo Anti-Oct4 | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anticorpo Anti-TRA-1-60 Anticorpo | Millipore | MAB4360 | |
| Anticorpo Anti-Sox2 | Biolegend | 630801 | |
| Anticorpo Anti-TRA-1-81 Anticorpo | Millipore | MAB4381 | |
| Anticorpo Anti-Klf4 | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H + L) anticorpo | Sonda molecolare | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H + L) | anticorpo Sonda molecolare | A11037 | |
| DAPI | Sonda molecolare | D1306 | |
| Prolong oro antisbiadimento reagente | Invitrogen | P36934 | |
| vetrino, rivestito | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Cloroformio | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprilalcol | Milliporo | 109634 | |
| Etanolo | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid Kit di sintesi di cDNA a primo filamento | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA polimerasi | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Tampone | Life Technologies | 15581-044 | |
| stella di carico | Dyne Bio | A750 | |
| Agarosio | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) Marcatore a scala del DNA | Enzimiche | DM003 | |
| Fosfatasi alcalina | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Tampone |
| Cloruro di sodio | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Tampone di risciacquo |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Tampone di risciacquo |
| Acido cloridrico | Duksan | 1129 | Tampone di risciacquo |
Riferimenti
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a plur....
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