De arterioveneuze (AV) Loop in een klein proefdiermodel voor Angiogenese en Gevasculariseerd Tissue Engineering Studie

Summary

We beschrijven een microchirurgische benadering voor het genereren van een arterioveneuze (AV) -lus als model voor het analyseren van vascularisatie in vivo in een geïsoleerd en goed gekarakteriseerd omgeving. Dit model is niet alleen nuttig voor het onderzoek naar angiogenese, maar ook optimaal geschikt voor engineering axiaal gevasculariseerd en transplantable weefsels.

Abstract

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient’s needs.

Introduction

De meeste weefsels en organen in het menselijk lichaam zijn afhankelijk van een functionele bloedvat netwerk levert voedingsstoffen, gassen en wisselt afvalstoffen af. Storing van dit systeem veroorzaakt door lokale of systemische vasculaire problemen kunnen leiden tot een groot aantal ernstige ziekten. Bovendien is in onderzoeksgebieden zoals tissue engineering en regeneratieve geneeskunde, een functioneel bloedvat netwerk binnen kunstmatig opgewekte weefsels of getransplanteerde organen is onontbeerlijk voor een succesvolle klinische toepassing.

Decennia onderzoekers hebben onderzoek de exacte mechanismen betrokken bij de groeiende vaatstelsel dieper inzicht in pathologische situaties krijgen om nieuwe therapeutische interventies vinden en een betere preventie van vasculaire aandoeningen. In de eerste stap worden basisprocessen zoals cel-cel interacties en het effect van moleculen op cellen van het vasculaire systeem gewoonlijk onderzocht door in vitro 2D of 3Dexperimenten. Traditionele 2D modellen zijn eenvoudig uit te voeren, zijn goed ingeburgerd en hebben sterk bijgedragen tot een beter begrip van deze processen. Voor het eerst in 1980, Folkman et al. gerapporteerd in vitro angiogenese zaaien van capillaire endotheelcellen op met gelatine beklede platen ^1. Dit gaf onmiddellijk manier om publicatie van een groot aantal verdere 2D angiogenese experimenten op endotheliale cellen buisvorming assay ^2, migratieanalyse ³ en de co-kweken van verschillende celtypen ^4, evenals anderen. Deze testen worden vandaag nog steeds gebruikt en geaccepteerd als standaard in vitro methoden.

Echter, deze experimentele opzet is niet altijd geschikt voor de studie van de in vivo celgedrag omdat de meeste celtypen vereisen een 3D-omgeving relevante fysiologische weefselstructuren ⁵ vormen. Het kon worden aangetoond dat de architectuur van het 3D matrix bepalend voor capillaire morphogenesis ⁶ en die cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties en 3D kweekomstandigheden reguleren belangrijke factoren die betrokken zijn bij tumor angiogenese ^7. De 3D-matrix biedt complexe mechanische inputs, kunnen effector eiwitten binden en vast weefsel schaal opgeloste stof concentratie gradiënten. Bovendien is het noodzakelijk geacht om na te bootsen in vivo morfogenetische en remodeling stappen in complexe weefsels ^5. In deze systemen kunnen zowel angiogenese en vasculogenese bestudeerd. Hoewel angiogenese beschrijft de kiemen van capillairen uit reeds bestaande bloedvaten ^8, vasculogenese betrekking op de de novo vorming van bloedvaten door de endotheliale cellen of hun progenitors ^9,10. Rijping van schepen wordt beschreven in een proces genaamd 'arteriogenese' via rekrutering van gladde spiercellen ^11. Een typische angiogene in vitro model de kiemen van endotheelcellen van bestaande monolaags geënt als een monolaag op gel oppervlakken op oppervlakte microbolletjes ingebed in een gel of door het bouwen van endotheelcellen sferoïden ^12. In vasculaire endotheelcellen enkele modellen worden ingesloten in een 3D gel. Ze met aangrenzende endotheelcellen vasculaire structuren en netwerken de novo vormen, gewoonlijk in combinatie met ondersteunende cellen ^12.

Zelfs complexe 3D in vitro modellen kunnen nabootsen in vivo instellingen volledig omdat er meerdere cel-cel en cel-ECM interacties ^13. Stoffen met hoge in vitro activiteit niet automatisch hetzelfde effect in vivo en vice versa ¹⁴ tonen. Voor een uitgebreide analyse van vascularisatie processen is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling in vivo modellen die de situatie in het lichaam beter te simuleren. Een groot aantal in vivo angiogenese assays worden beschreven in de literatuur, waaronder dechick chorion membraan assay (CAM), de zebravis model, de cornea angiogenese assay, de dorsale luchtzak model, de dorsale huidplooi kamer, de onderhuidse tumor modellen ^14. Echter, deze assays vaak geassocieerd met beperkingen, zoals snelle morfologische veranderingen, problemen bij het onderscheiden van nieuwe capillairen uit reeds bestaande in de CAM-bepaling, of de beperkte ruimte in het corneale angiogenese assay ^15. Bovendien worden niet-zoogdierlijke systemen (bv., De zebravis model ^16), hetgeen leidt tot problemen bij xenotransplantatie ^17. In het subcutane tumormodel, kunnen angiogenese alleen afkomstig zijn van de tumor zelf niet worden geanalyseerd aangezien het aangrenzende weefsel mate bijdraagt ​​tot de vascularisatie proces. Bovendien kan het omringende weefsel een beslissende rol bij de vorming van de tumor micro ¹⁸ hebben.

Niet alleen voor de studie van angiogenese of vasculogenese is er een sterke need voor een gestandaardiseerde en goed gekarakteriseerd in vivo model, maar ook voor het bestuderen van verschillende strategieën vascularisatie in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Vandaag de vorming van complexe kunstmatige organen of weefsels kan zowel in vitro als in vivo. 3D bioprinting biedt een on-demand fabricage techniek voor het genereren van complexe 3D-functionele levende weefsels ^19. Bovendien kan bioreactoren worden gebruikt voor het genereren weefsels ²⁰ of het lichaam kan worden gebruikt als bioreactor ^21. De belangrijkste barrière voor succesvolle toepassing van kunstmatig opgewekte weefsels het ontbreken van vascularisatie in de gemanipuleerde constructen. Directe verbinding met vasculatuur van de gastheer na transplantatie is een belangrijke voorwaarde om te overleven, vooral bij grote kunstmatige weefsels of organen.

Verschillende in vitro en in vivo prevascularization strategieën waren ontwikkeld om een functionele microvasculatuur in constructies te vestigen voorafgaand aan implantatie ^22. De implantatie van een steiger met in vitro gemanipuleerde voorgevormde haarvaten op de dorsale huid van muizen leidde tot snelle anastomose van de muizen vasculatuur binnen een dag ^23. Daarentegen een sferoïde co-cultuur, bestaande uit menselijke mesenchymale stamcellen en humane navelstrengader endotheelcellen samengesteld tot een driedimensionaal netwerk prevascular verder ontwikkeld na in vivo implantatie. Echter, anastomose met de gastheer vasculatuur beperkt ^24. Vooral in slecht gevasculariseerde gebreken, zoals necrotische of bestraalde gebieden, deze zogenaamde extrinsieke vascularisatie – de ingroei van vaten uit de omgeving in de scaffold – vaak niet. Intrinsieke vascularisatie, anderzijds, is gebaseerd op een vasculaire as als bron van nieuwe capillairen kiemen in de scaffold ^25. Met de axiale vascularisatie benaderingDe gemanipuleerde weefsel kan worden getransplanteerd met vasculaire as en verbonden met lokale schepen op de receptorplaats. Onmiddellijk na de transplantatie, is het weefsel voldoende ondersteund door zuurstof en voedingsstoffen, die de juiste voorwaarden voor een optimale integratie creëert.

Vanwege de beperkte beschikbaarheid van modellen voor het onderzoek in vivo angiogenese en in de erkenning van het toenemende belang van het genereren van axiaal doorbloed weefsel, ontwikkelden we de microchirurgische benadering van Erol en Spira naar aanleiding van een arterioveneuze (AV) lus in het diermodel ²⁶ te genereren. Het gebruik van een volledig gesloten implantatiekamer maakt deze methode zeer geschikt voor bloedvatvorming studeren onder "gecontroleerde", goed gekarakteriseerd in vivo omstandigheden (figuur 1). Dit model is niet alleen nuttig voor het onderzoek naar angiogenese maar ook optimaal geschikt voor axiale vascularisatie van scaffolds voor weefsel enginEering doeleinden.

Protocol

Het Animal Care Comite van de Friedrich-Alexander Universiteit van Erlangen-Nürnberg (FAU) en de regering van het Midden-Franken, Duitsland, goedgekeurd alle experimenten. Voor de experimenten mannelijke Lewis ratten met een lichaamsgewicht van 300 – 350 g werden gebruikt. 1. De arterioveneuze Loop Model in het Rat Implantatieprocedure (figuur 2) Voor verdoving een speciale plastic doos die via buis is verbonden met de verdamper isofluraan en afgesloten door een dek…

Representative Results

tissue engineering Voor botweefsel doeleinden verschillende botvervangers geïmplanteerd in het kleine dier rat AV lusmodel 27,28,33,34. Vascularisatie kan perfect worden aangetoond door 3D-micro computertomografie (micro-CT) (Figuur 3A). Vascularisatie van een verwerkt bovine poreus bot (PBCB) matrix was significant hoger in de lus vergeleken met de groep zonder vascularisatie. Een steeds groter en maturating bloedvat netwerk ontwikkel…

Discussion

Al meer dan tien jaar, hebben we met succes gebruik gemaakt van de arterioveneuze (AV) lus voor tissue engineering doeleinden en het bestuderen van angiogenese in vivo in de kleine diermodel. Wij konden aantonen dat dit microchirurgische model is zeer geschikt voor engineering van verschillende weefsels en het kan ook worden gebruikt voor angiogenese of anti-angiogenese studies.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
Gema…

Materials

0.9% sodium chloride	Berlin-Chemie AG	34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6	Ethicon	EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910	Ethicon	V392H
6-0 Prolene / polypropylene	Ethicon	8695H
aluminium spray	Pharma Partner Vertriebs-GmbH	1020
antiseptics	BODE Chemie GmbH
Catheter	B Braun Meslungen AG	4251612-02
contrast agent	Flowtech	MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution	Intervet International GmbH
encre de chine intense indian ink	Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin	Bayer AG
eye ointment	Bayer AG
Formalin 4 %	Carl Roth GmbH & Co. KG	P087.4
Heparin	Ratiopharm GmbH
isoflurane	Abbott Laboratories	6055482
Lewis rat, male	Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium	Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N	Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal	Grünenthal GmbH