Loop Arteriovenous (AV) в модели мелких животных для изучения ангиогенеза и васкуляризированных тканевой инженерии

Summary

Мы описываем микрохирургической подход к генерации артериовенозные (AV) петли в качестве модели для анализа васкуляризации в естественных условиях в изолированном и хорошо охарактеризованного окружающей среды. Эта модель не только полезно для исследования ангиогенеза, но и оптимально подходит для инженерных и аксиально васкуляризированных перевивных тканей.

Abstract

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient’s needs.

Introduction

Большинство тканей и органов в организме человека зависят от функциональной сети сосудов крови, которая поставляет питательные вещества, газы и обменивает удаляет продукты жизнедеятельности. Неисправность этой системы, вызванной местными или системными проблемами сосудов может привести к множеству серьезных заболеваний. Кроме того, в научных областях, таких как тканевой инженерии или восстановительной медицины, функциональная сеть кровеносных сосудов в искусственно созданных тканей или пересаженных органов является необходимым условием для успешного клинического применения.

В течение десятилетий исследователи исследовали точные механизмы, участвующие в растущей сосудистую сеть, чтобы получить более глубокое понимание патологических ситуаций, с тем чтобы найти новые терапевтические вмешательства и обеспечить более профилактики сосудистых расстройств. На первом этапе, основные процессы , такие как межклеточных взаимодействий или влияния молекул на клетках сосудистой системы, как правило , исследовали с помощью экстракорпорального 2D или 3Dэксперименты. Традиционные 2D модели легко выполнить, хорошо известны и в значительной степени способствовали лучшему пониманию этих процессов. Впервые в 1980 году, Фолкман и др. сообщили в пробирке ангиогенеза высева клеток эндотелия капилляров на желатине планшетах , покрытых ^1. Это сразу же уступила публикации множества дальнейших экспериментов 2D ангиогенеза на клеточной трубки эндотелиальной формирования анализа ^{2, 3} анализа миграции и совместного культивирования различных типов клеток ^4, а также другие. Эти анализы все еще используются сегодня и принят в качестве стандарта в пробирке методами.

Тем не менее, эта экспериментальная установка не всегда подходит для изучения поведения клеток в естественных условиях , так как большинство типов клеток требуют 3D – среде , чтобы сформировать соответствующие физиологические структуры ткани ^5. Можно показать, что архитектура 3D-матрицы имеет решающее значение для капиллярного morphogenesiS ⁶ и что клеточно-внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия и 3D культуры условия регулируют важные факторы , связанные с опухолевого ангиогенеза ^7. 3D матрица обеспечивает сложные механические входы, могут связывать эффекторные белки и устанавливают ткани масштабные градиенты концентрации растворенного вещества. Кроме того, считается необходимым для того , чтобы имитировать в естественных условиях морфогенетических и ремоделирования шагов в сложных тканей ^5. В этих системах, как ангиогенез и образование и развитие сосудов могут быть изучены. В то время как ангиогенез описывает прорастание капилляров из уже существующих кровеносных сосудов ^8, образование и развитие сосудов относится к образованию де Novo кровеносных сосудов через эндотелиальных клеток или их предшественников ^9,10. Созревание судов описывается в процессе , называемом 'артериогенеза' с помощью набора гладких мышечных клеток ^11. Типичным развитие кровеносных сосудов в пробирке модель является разрастание эндотелиальных клеток из существующих монослояс затравку в виде монослоя на поверхности геля, на поверхности микросфер , внедренных в геле или путем создания эндотелиальные сфероиды ¹² клеток. В моделях васкулогенных одиночные эндотелиальные клетки захватываются в 3D-гель. Они взаимодействуют с соседними эндотелиальными клетками с образованием структур и сетей De Novo сосудов, как правило , в сочетании с поддерживающими клетками ^12.

Тем не менее, даже комплекс 3D в моделях пробирке не могут имитировать в условиях естественных условиях полностью учитывая множество межклеточных и клеточно-ECM взаимодействиях ^13. Вещества , обладающие высокой активностью в пробирке автоматически не показывают те же эффекты в естественных условиях и наоборот ^14. Для всестороннего анализа процессов васкуляризации существует острая необходимость в разработке в естественных условиях модели , которые лучше имитируют ситуацию в организме. Большой диапазон в естественных условиях ангиогенеза анализы описаны в литературе, в том числехорионалантоисной анализ мембраны (САМ), то модель данио, роговичный ангиогенез анализа, спинной модель воздушный мешок, спинной складка камеры, подкожные модели опухоли ^14. Тем не менее, эти анализы часто связаны с ограничениями, такими как быстрые морфологические изменения, проблемы в различении новых капилляров из уже существующих в анализе САМ, или ограниченное пространство в роговице ангиогенеза анализе ^15. Кроме того, системы немлекопитающего используются (например., То данио модель ^16), что приводит к проблемам в ксенотрансплантации ^17. В модели подкожной опухоли, ангиогенез, происходящих только из самой опухоли не могут быть проанализированы, так как прилежащие ткани в значительной степени способствует процессу васкуляризации. Кроме того, окружающие ткани могут иметь решающую роль в формировании микросреды ¹⁸ опухолей.

Не только для изучения ангиогенеза или васкулогенеза есть сильный пее изд для стандартизированной и хорошо охарактеризованный в естественных условиях модели , но и для изучения различных стратегий васкуляризации в тканевой инженерии и регенеративной медицины. На сегодняшний день создание сложных искусственных органов или тканей возможно как в пробирке и в естественных условиях. 3D-Биопринтинг обеспечивает технологию изготовления по требованию для создания сложных 3D – ткани функциональной жизни ^19. Кроме того, биореакторы могут быть использованы для создания тканей ²⁰ или даже собственное тело может быть использован в качестве биореактора ^21. Тем не менее, основным препятствием для успешного применения искусственно созданных тканей является отсутствие васкуляризации в инженерно-технических конструкций. Немедленное соединение с сосудистой сетью хозяина после трансплантации является важной предпосылкой для выживания, особенно в случае крупных искусственных тканей или органов.

Различные в пробирке или в естественных условиях стратегий prevascularization были развиOped установить функциональную микроциркуляторного русла в конструкциях до имплантации ^22. Имплантация помост с ин витро предварительно сформированных сконструированных капилляров на коже спины мышей приводило к быстрому анастомоза мышей сосудистую систему в течение ²³ -й день. В противоположность этому , сфероид совместно культуры , состоящей из человеческих мезенхимальных стволовых клеток и эндотелиальных клеток пупочной вены человека , собранных в трехмерную сеть prevascular дальнейшее развитие после имплантации в естественных условиях. Тем не менее, анастомоз с принимающей сосудистую сеть была ограничена ^24. Прежде всего, в плохо васкуляризированных дефектов, таких как некротических или облученные областях, это так называемая внешняя васкуляризация – врастание сосудов из окрестностей в эшафоте – часто выходит из строя. Характеристическая васкуляризации, с другой стороны, основано на сосудистом оси в качестве источника новых капилляров прорастающих в строительные леса ^25. Используя васкуляризации подход осевой, Инженерией ткани можно пересаживать с его осью сосудистых и соединен с местным судам на месте получателя. Сразу же после трансплантации, ткань адекватно поддерживается кислородом и питательными веществами, что создает благоприятные условия для оптимальной интеграции.

Из – за ограниченной доступности моделей для исследования ангиогенеза в естественных условиях и в знак признания растущей важности создания осевого васкуляризированных ткани, мы разработали микрохирургической подход Эрол и Спира далее для создания артериовенозного (AV) цикл в животной модели ^26. Использование полностью закрытой имплантации камеры делает этот метод очень хорошо подходит для изучения формирования кровеносных сосудов под "контролируемой", хорошо охарактеризованы в условиях естественных условиях (рисунок 1). Эта модель не только полезно для исследования ангиогенеза, но также оптимально подходит для осевого васкуляризации каркасы для Engin тканиЦели eering.

Protocol

Уход за комитет Животный Фридриха-Александра университета Эрланген-Нюрнберга (FAU) и правительство Средней Франконии, Германия, одобрила все эксперименты. Для экспериментов, самцов крыс линии Lewis с массой тела 300 – использовали 350 г. 1. Цикл Модель Arteriovenous в Rat Процедура Импла?…

Representative Results

тканевая инженерия Для технических целей костной ткани, были имплантированы целый ряд различных заменителей костной ткани в небольшом животных крысы модели AV петля 27,28,33,34. Васкуляризация вполне может быть продемонстрировано с помощью 3D микро-комп…

Discussion

Уже более десяти лет мы успешно использовали артериовенозного (AV) петля для тканевой инженерии целей и изучения ангиогенеза в естественных условиях в небольшой животной модели. Можно показать, что эта микрохирургической модель очень хорошо подходит для создания модифицированны?…

Materials

0.9% sodium chloride	Berlin-Chemie AG	34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6	Ethicon	EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910	Ethicon	V392H
6-0 Prolene / polypropylene	Ethicon	8695H
aluminium spray	Pharma Partner Vertriebs-GmbH	1020
antiseptics	BODE Chemie GmbH
Catheter	B Braun Meslungen AG	4251612-02
contrast agent	Flowtech	MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution	Intervet International GmbH
encre de chine intense indian ink	Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin	Bayer AG
eye ointment	Bayer AG
Formalin 4 %	Carl Roth GmbH & Co. KG	P087.4
Heparin	Ratiopharm GmbH
isoflurane	Abbott Laboratories	6055482
Lewis rat, male	Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium	Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N	Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal	Grünenthal GmbH