Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

Summary

Descriviamo un approccio microchirurgico per la generazione di un loop arterovenosa (AV) come un modello di analisi vascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Questo modello non è solo utile per l'indagine di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per l'ingegneria vascolarizzato assialmente e tessuti trapiantabili.

Abstract

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.

We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment.

In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient’s needs.

Introduction

La maggior parte dei tessuti e organi del corpo umano sono dipendenti da una rete di vasi sanguigni funzionale che fornisce nutrienti, scambia gas e rimuove i residui. Malfunzionamento del sistema causati da problemi vascolari locali o sistemici può portare a una moltitudine di malattie gravi. Inoltre, in aree di ricerca quali l'ingegneria tissutale o medicina rigenerativa, una rete di vasi sanguigni funzionali all'interno dei tessuti generati artificialmente o organi trapiantati è indispensabile per l'applicazione clinica di successo.

Per decenni i ricercatori hanno studiato gli esatti meccanismi coinvolti nella crescita vascolare al fine di conoscere più a fondo le situazioni patologiche al fine di trovare nuovi interventi terapeutici e fornire una migliore prevenzione dei disturbi vascolari. Nella prima fase, processi di base quali le interazioni cellula-cellula o l'effetto di molecole sulle cellule del sistema vascolare sono solitamente studiati in vitro 2D o 3Desperimenti. modelli 2D tradizionali sono di facile esecuzione, sono ben noti e hanno contribuito notevolmente ad una migliore comprensione di questi processi. Per la prima volta nel 1980, Folkman et al. segnalato nell'angiogenesi vitro semina delle cellule endoteliali capillari sulla gelatina piastre rivestite ^1. Questo ha dato immediatamente modo per pubblicazione di una moltitudine di ulteriori esperimenti angiogenesi 2D su tubo cellule endoteliali formazione test ^2, dosaggio migrazione ³ e la co-coltura di tipi cellulari ^4, così come gli altri. Questi test sono ancora in uso oggi e accettato come standard metodi in vitro.

Tuttavia, questa configurazione sperimentale non è sempre appropriato per lo studio del comportamento delle cellule in vivo poiché la maggior parte tipi cellulari richiedono un ambiente 3D per formare pertinenti strutture dei tessuti fisiologici ^5. Si è potuto dimostrare che l'architettura della matrice 3D è decisiva per capillare morphogenesiS ⁶ e che le interazioni cellula-extra matrice extracellulare (ECM) e cultura 3D condizioni regolano importanti fattori coinvolti nella angiogenesi tumorale ^7. La matrice 3D fornisce ingressi meccanici complessi, in grado di legare le proteine ​​effettrici e stabilire gradienti di concentrazione del soluto dei tessuti scala. Inoltre, si ritiene necessario per imitare di morfogenetica vivo e passaggi rimodellamento dei tessuti complessi ^5. In questi sistemi, sia angiogenesi e vasculogenesi possono essere studiate. Mentre angiogenesi descrive la germinazione dei capillari da vasi sanguigni preesistenti ^8, vasculogenesi si riferisce alla formazione de novo dei vasi sanguigni attraverso le cellule endoteliali o dei loro progenitori ^9,10. La maturazione dei vasi è descritto in un processo chiamato 'arteriogenesis' attraverso il reclutamento delle cellule muscolari lisce ^11. Un angiogenico tipico modello in vitro è la germinazione delle cellule endoteliali da monostrato esistentes testa di serie come un monostrato su superfici gel, sulla superficie di microsfere incorporati all'interno di un gel o con la costruzione di sferoidi di cellule endoteliali ^12. Nei modelli vascolare cellule endoteliali singoli sono intrappolate in un gel 3D. Essi interagiscono con le cellule endoteliali adiacenti per formare strutture e reti de novo vascolari, tipicamente in combinazione con cellule di supporto ^12.

Tuttavia, anche complessa di 3D di modelli in vitro non possono mimare nelle impostazioni vivo completamente dato il gran numero di cellula-cellula e cellula-ECM Interazioni ^13. Le sostanze con un'elevata attività in vitro non mostrano automaticamente gli stessi effetti in vivo e viceversa ^14. Per un'analisi completa di vascolarizzazione processi vi è un urgente bisogno di sviluppare modelli in vivo che meglio simulano la situazione nel corpo. Una vasta gamma di test in vivo di angiogenesi sono descritti in letteratura, tra cui lasaggio pulcino chorioallantoic membrana (CAM), il modello di pesce zebra, il saggio di angiogenesi corneale, il modello di sacca d'aria dorsale, la camera di dorsali plica, i modelli di tumore sottocutaneo ^14. Tuttavia, questi test sono spesso associate a limitazioni, come ad esempio i cambiamenti morfologici rapidi, i problemi nel distinguere nuovi capillari da quelli già esistenti nel test CAM, o lo spazio limitato nel saggio di angiogenesi corneale ^15. Inoltre, vengono utilizzati sistemi non mammiferi (ad es., Il modello zebrafish ^16), che porta a problemi xenotrapianto ^17. Nel modello di tumore sottocutaneo, angiogenesi originari soltanto dal tumore stesso non può essere analizzato in quanto il tessuto adiacente contribuisce notevolmente al processo di vascolarizzazione. Inoltre, il tessuto circostante può avere un ruolo decisivo nel plasmare il microambiente tumorale ^18.

Non solo per lo studio dell'angiogenesi o vasculogenesi c'è un forte NEEd un standardizzato e ben caratterizzato modello in vivo, ma anche per lo studio delle diverse strategie di vascolarizzazione in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Oggi, la generazione di organi artificiali complessi o tessuti è possibile sia in vitro che in vivo. 3D bioprinting fornisce una tecnica di fabbricazione on-demand per la generazione di tessuti viventi funzionale complesso 3D ^19. Inoltre, bioreattori possono essere utilizzati per generare tessuti ²⁰ o persino il proprio corpo può essere utilizzato come bioreattore ^21. Tuttavia, la barriera principale per applicazione di successo di tessuti generati artificialmente è la mancanza di vascolarizzazione all'interno dei costrutti ingegnerizzati. collegamento immediato vascolare dell'ospite dopo il trapianto è un presupposto fondamentale per la sopravvivenza, specialmente nel caso di tessuti artificiali larga scala o organi.

Diverso in vitro o in vivo strategie prevascularization erano develpato per stabilire una microcircolo funzionale costrutti prima dell'impianto ^22. L'impianto di un ponteggio con in vitro capillari ingegnerizzati preformati sulla pelle dorsale di topi ha portato ad una rapida anastomosi vascolare topi entro un giorno ^23. Al contrario, una co-coltura sferoide costituito da cellule staminali mesenchimali umane della vena ombelicale e cellule endoteliali umane assemblate in una rete prevascolare tridimensionale sviluppato ulteriormente dopo l'impianto in vivo. Tuttavia, anastomosi con il sistema vascolare host è stato limitato ^24. Soprattutto, in difetti poco vascolarizzati, come le aree necrotiche o irradiate, questa cosiddetta estrinseca vascolarizzazione – la crescita interna dei vasi della zona circostante in patibolo – spesso non riesce. Vascolarizzazione intrinseca, invece, si basa su un asse vascolare come fonte di nuovi capillari germinazione nella scaffold ^25. Utilizzando l'approccio vascolarizzazione assiale, L'ingegneria tessutale può essere trapiantato con il suo asse vascolare e collegato alle navi locali nel sito ricevente. Immediatamente dopo il trapianto, il tessuto è adeguatamente supportato da ossigeno e sostanze nutritive, che crea le condizioni per l'integrazione ottimale.

A causa della limitata disponibilità di modelli per lo studio dell'angiogenesi in vivo e in riconoscimento della crescente importanza di generare tessuti assialmente vascolarizzato, abbiamo sviluppato l'approccio microchirurgico di Erol e Spira ulteriormente per generare un loop (AV) artero nel modello animale ^26. L'uso di una camera di impiantazione completamente chiusa rende questo metodo molto adatto per studiare la formazione di vasi sanguigni in "controllata", ben caratterizzata di condizioni in vivo (Figura 1). Questo modello non è utile solo per le indagini di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per la vascolarizzazione assiale di ponteggi per Engin tessutofini eering.

Protocol

Il Comitato Animal Care del Friedrich-Alexander di Erlangen-Norimberga (FAU) e il governo della Media Franconia, in Germania, ha approvato tutti gli esperimenti. Per gli esperimenti, i ratti Lewis maschi con un peso corporeo di 300 – sono stati usati 350 g. 1. The Loop Modello artero nel ratto Impianto Procedura (Figura 2) Per anestesia utilizzare una scatola di plastica speciale che è collegata tramite tubo al vaporizzatore isoflurano e chiusa da un coperchio. Acce…

Representative Results

Ingegneria dei tessuti Per scopi di ingegneria del tessuto osseo, diversi sostituti ossei sono stati impiantati nel piccolo animale ratto modello ciclo AV 27,28,33,34. Vascolarizzazione potrebbe perfettamente essere dimostrata da 3D micro-tomografia computerizzata (micro-CT) (Figura 3A). Vascolarizzazione di una matrice bovina elaborato osso spugnoso (PBCB) è risultata significativamente più alta nel gruppo ciclo rispetto al gruppo se…

Discussion

Per oltre un decennio, abbiamo utilizzato con successo il ciclo (AV) artero per scopi di ingegneria tissutale e l'angiogenesi studiare in vivo nel piccolo modello animale. Potremmo dimostrare che questo modello di microchirurgia è molto adatto per l'ingegneria dei tessuti diversi e che può essere utilizzato anche per studi di angiogenesi o antiangiogenesi.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
Tessuti o organi ingeg…

Materials

0.9% sodium chloride	Berlin-Chemie AG	34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6	Ethicon	EH7438G
4-0 Vicryl / polygalactin 910	Ethicon	V392H
6-0 Prolene / polypropylene	Ethicon	8695H
aluminium spray	Pharma Partner Vertriebs-GmbH	1020
antiseptics	BODE Chemie GmbH
Catheter	B Braun Meslungen AG	4251612-02
contrast agent	Flowtech	MV-122
embutramide, mebezonium iodide, tetracaine hydrochloride injectable solution	Intervet International GmbH
encre de chine intense indian ink	Lefranc & Bourgeois
Enrofloxacin	Bayer AG
eye ointment	Bayer AG
Formalin 4 %	Carl Roth GmbH & Co. KG	P087.4
Heparin	Ratiopharm GmbH
isoflurane	Abbott Laboratories	6055482
Lewis rat, male	Charles River Laboratories
Metamizol-Natrium	Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron N	Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / Tramal	Grünenthal GmbH