ジカウイルス感染細胞培養系と<em>インビトロ</emインターフェロンの>予防効果
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、眼の欠陥、および成長障害などの胎児の発育異常にリンクされている新興病原体です。 ZIKVは、 フラビウイルス科のRNAウイルスです。 ZIKVは主に蚊によって送信されるだけでなく、胎児の垂直感染への母体だけでなく、性的接触によって広げることができます。現在までに、ウイルスに感染したものを保護するために利用可能な信頼性の高い治療法やワクチンのオプションがありません。再現性のある、効果的なジカウイルス感染細胞培養系の開発はZIKV複製だけでなく、薬物およびワクチン開発の分子メカニズムを研究するために重要です。この点で、ウイルス産生および増殖の分析のために哺乳動物細胞に基づくインビトロジカウイルス培養系内を記述するプロトコルはここで報告されます。ウイルス力価を測定するための細胞単層およびプラークアッセイにジカウイルスによってプラークの形成の詳細が提示されています。ウイルスゲノムの複製動態二本鎖RNAゲノムreplicatory中間体が決定されます。この培養プラットフォームはZikaウイルス増殖の強力な阻害剤として、インターフェロン-α（IFN-α）、IFN-βおよびIFN-γの識別結果としてのサイトカインの小さなセットのライブラリーに対してスクリーニングするために利用されました。要約すると、in vitroでの感染Zikaウイルス培養系と様々なウイルス学的ア ッセイが大きく、さらにウイルスの病原性とウイルスの病原性の進化のメカニズムの解明に研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めているこの研究で実証されています。抗ウイルスIFN-αは、さらに感染した妊婦を含む高リスク集団におけるジカウイルス感染症の予防、露光後、予防、および治療の選択肢として評価することができます。
Introduction
ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、貧しい妊娠1,4を成果に関連した重要なヒト病原体です。 ZIKVは、デング熱、西ナイル、セントルイス脳炎ウイルスなどの神経学的欠陥を引き起こす可能性が医学的に関連するフラビウイルスのセットに属します。ウイルス伝播の主なモードに加えて、性行為も5,6報告されている、蚊ベクターネッタイシマカによるものである、と。 ZIKVが原因蚊ベクトルの拡大地理的分布と先天性欠損症との強い相関関係に世界の主要な健康問題となっています。 ZIKVが最初Zika林におけるセンチネルアカゲザルから1947年に単離された、ウガンダ、最初の人間の場合は1952 7,8で報告されました。発熱、発疹、頭痛、結膜炎、および筋肉/関節痛などの軽度の症状を示すZIKVに感染する個人。感染した妊婦は胎児1にZIKVを送信することができます。 ZIKV感染はまた、ギラ ン・バレー症候群、末梢神経自己免疫脱髄障害9に関連しています。
Zikaウイルスゲノムは、長さが約10.8キロベースであるプラスセンス一本鎖RNA分子から成ります。ゲノムの構造は、タンパク質コード領域に隣接する非コード領域（NCR）と、5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCRとして編成されています6。単一のポリタンパク質（3419 AA）はコポリマーおよび翻訳後10より小さなペプチドに切断されている翻訳されています。 5'NCRと3'NCR RNAステム – ループ構造の両方は、ウイルスゲノムの翻訳および複製の開始に重要な役割を果たしています。ゲノムの構造部品はキャプシド、膜およびエンベロープタンパク質で構成されています。非構造タンパク質は、ゲノム複製のために重要です。
現在、Zikaウイルス株は、3つの主要な遺伝子型に分類されます。西アフリカ、東アフリカ、そしてアジア6,10-13。それは、後にさらに12を進化させ西アフリカとアジア、に東アフリカ系統普及ことが提案されています。アジアの遺伝子型は、アメリカの現在の集団発生の原因です。ジカウイルスは、蚊及び哺乳動物細胞の両方において培養することができます。一次皮膚線維芽細胞、未熟樹状細胞、皮質神経前駆細胞、およびベロ細胞がZikaウイルス感染10,14,15を受けやすいです。両方のI型およびII型インターフェロンは、皮膚線維芽細胞15でZIKV成長を抑制することが示されています。この研究の目的は、哺乳動物細胞培養系におけるアジア遺伝子型ZIKAウイルス株PRVABC59の産生およびアッセイのための段階的な詳細なプロトコルを提供し、薬剤開発プラットフォームとしてこの感染培養系の有用性を実証することです。このリソースは大幅にさらに私を解明するZikaウイルスおよび神経学的研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めていますウイルスの病原性のウイルスの病原性と進化のtsのメカニズム。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、in vitroでジカウイルスを培養するための合理化されたプロトコルが提示されます。含む、ウイルス培養を拡大するための最適なエンドポイントを識別し、力価を測定し、ゲノムの複製を定量化する重要なステップを提供しました。ジカウイルスは、感染性物質の処理中に、生物学的安全手順が厳密に従うべきであり、人間の病原体である、そう。サル腎臓細胞株、ベロは、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
Riferimenti
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
