Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em> In Vitro</em> Profiláctica Efecto de los interferones
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika Virus (ZIKV) es un patógeno emergente que está vinculado a anomalías en el desarrollo del feto, como microcefalia, defectos oculares y problemas de crecimiento. ZIKV es un virus ARN de la familia Flaviviridae. ZIKV se transmite principalmente a través de los mosquitos, pero también puede ser transmitida por la madre a la transmisión vertical del feto, así como el contacto sexual. Hasta la fecha, no existen opciones de tratamiento o vacunas fiables disponibles para proteger a las personas infectadas por el virus. El desarrollo de un sistema reproducible y eficaz de virus Zika infecciosa cultivo celular es fundamental para el estudio de los mecanismos moleculares de la replicación ZIKV así como el desarrollo de medicamentos y vacunas. En este sentido, se informa aquí un protocolo que describe un sistema de mamífero basado en células in vitro Zika virus de cultivo para el análisis de la producción y el crecimiento viral. Se presentan detalles sobre la formación de placas por el virus Zika en una monocapa de células y la placa de ensayo para medir el título viral. la cinética de replicación del genoma viraly los intermedios replicatory de doble cadena de ARN del genoma se determinan. Esta plataforma de cultivo se utiliza para la pantalla contra una biblioteca de un pequeño conjunto de citoquinas que resultan en la identificación de interferón α (IFN-α), IFN-β y IFN-γ como inhibidores potentes de crecimiento viral Zika. En resumen, un sistema in vitro infecciosa viral Zika la cultura y diversos ensayos virológicos se ponen de manifiesto en este estudio, que tiene el potencial de beneficiar en gran medida la comunidad de investigación para dilucidar aún más los mecanismos de patogénesis viral y la evolución de la virulencia del virus. Antiviral de IFN-alfa más se puede evaluar como profiláctico posterior a la exposición, y la opción profiláctica, el tratamiento de las infecciones por virus Zika en poblaciones de alto riesgo, incluidas las mujeres embarazadas infectadas.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) es un importante patógeno humano asociado con microcefalia y los pobres resultados del embarazo 1,4. ZIKV pertenece al conjunto de los flavivirus médicamente relevantes que pueden causar defectos neurológicos tales como el dengue, del Nilo Occidental, y virus de la encefalitis de San Luis. El principal modo de transmisión viral es por el mosquito vector Aedes aegypti, y, además, la transmisión sexual también se ha informado de 5,6. ZIKV se ha convertido en un problema de salud mundial importante debido a la expansión de la distribución geográfica del mosquito vector y su fuerte correlación con defectos de nacimiento. ZIKV primero fue aislado en 1947 a partir de un mono rhesus centinela en el bosque Zika, Uganda y el primer caso humano se informó en 1952 7,8. Los individuos que se infectan con ZIKV presentarse con síntomas leves como fiebre, erupción cutánea, dolor de cabeza, conjuntivitis, dolor muscular y / conjunta. Las mujeres embarazadas infectadas pueden transmitir ZIKV al feto en desarrollo 1. ZIKV infección también se ha relacionado con el síndrome de Guillain-Barre, un trastorno del nervio periférico desmielinización autoinmune 9.
El genoma viral Zika consiste en un sentido positivo, molécula de ARN de cadena simple que es de aproximadamente 10,8 kilobases de longitud. La estructura del genoma está organizado como 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, con las regiones no codificantes (NCR) que flanquean una región codificadora de proteínas 6. Una sola poliproteína (3419 aa) se traduce en que es co- y post-translacional escindido en 10 péptidos más pequeños. Tanto el 5'NCR y las estructuras de tallo-bucle de ARN 3'NCR juegan un papel crítico en el inicio de la traducción del genoma viral y la replicación. Los componentes estructurales del genoma se componen de las proteínas de la cápside, de membrana, y el sobre. Las proteínas no estructurales son críticos para la replicación del genoma.
En la actualidad, las cepas virales Zika se agrupan en tres genotipos principales: África Occidental, África Oriental y Asia 6,10-13. Se ha propuesto que el linaje de África Oriental extendido a África Occidental y Asia, donde más tarde se convirtió otros 12. El genotipo asiático es responsable de los brotes actuales en las Américas. virus Zika se puede cultivar tanto en mosquitos y células de mamíferos. Fibroblastos primarios dérmicas, células dendríticas inmaduras, células progenitoras neuronales corticales y células Vero son susceptibles a la infección viral Zika 10,14,15. Ambos tipo I y tipo II interferones han demostrado restringir el crecimiento ZIKV en fibroblastos de la piel 15. Los objetivos de este estudio son proporcionar un protocolo detallado paso a paso para la producción y ensayando del genotipo asiático ZIKA PRVABC59 cepa viral en un sistema de cultivo de células de mamíferos y para demostrar la utilidad de este sistema de cultivo infecciosa como una plataforma de desarrollo de fármacos. Este recurso tiene el potencial de beneficiar en gran medida la comunidad de investigación neurológica viral y Zika para esclarecer aún más its mecanismos de patogénesis viral y la evolución de la virulencia del virus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se presenta un protocolo simplificado para el cultivo de virus Zika in vitro. Los pasos críticos incluyendo, identificando los puntos finales óptimas para la expansión del cultivo del virus, la medición de título, y se proporcionaron cuantificar la replicación del genoma. virus Zika es un patógeno humano, por lo que, durante la manipulación de agentes infecciosos, los procedimientos de bioseguridad deben ser seguidas estrictamente. Una línea de células de riñón de mono, Vero, se utilizó para…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
Riferimenti
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