Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em> In Vitro</em> Efeito profilático de interferões
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Vírus Zika (ZIKV) é um agente patogénico emergente que está ligada a anomalias do desenvolvimento fetal, tais como microcefalia, defeitos oculares, e comprometimento do crescimento. ZIKV é um vírus de RNA da família Flaviviridae. ZIKV é transmitido principalmente por mosquitos, mas também pode ser transmitida por maternal à transmissão vertical fetal, bem como o contato sexual. Até à data, não há nenhum tratamento ou vacinas fiáveis opções disponíveis para proteger as pessoas infectadas pelo vírus. O desenvolvimento de um sistema de cultura de células reprodutível, eficaz Zika vírus infeccioso é fundamental para o estudo dos mecanismos moleculares de replicação ZIKV, bem como o desenvolvimento de drogas e vacinas. A este respeito, um protocolo descrevendo um in vitro Zika sistema de cultura de mamífero com base em células de vírus para análise da produção e crescimento virai é aqui relatado. Os detalhes sobre a formação de placas de vírus Zika numa monocamada de células e ensaio de placa para medição título virai são apresentados. cinética de replicação do genoma virale intermediários replicatory de cadeia dupla do genoma de ARN são determinadas. Esta plataforma de cultura foi utilizado para a tela de encontro a uma biblioteca de um pequeno conjunto de citocinas, resultando na identificação de interferão-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ como potentes inibidores do crescimento virai Zika. Em resumo, um sistema in vitro infecciosa viral Zika cultura e vários ensaios virológicos são demonstrados neste estudo, que tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de investigação para elucidar ainda mais os mecanismos de patogénese viral e a evolução da virulência do vírus. Antiviral IFN-alpha pode ainda ser avaliada como um, profilático pós-exposição, e opção de tratamento profilático para infecções por vírus Zika em populações de alto risco, incluindo mulheres grávidas infectadas.
Introduction
Virus Zika (ZIKV) é um patógeno humano importante associado à microcefalia e pobres resultados perinatais 1,4. ZIKV pertence ao conjunto de flavivírus clinicamente relevantes que podem causar defeitos neurológicos, tais como o dengue, Nilo Ocidental, e vírus da encefalite de St. Louis. O principal modo de transmissão virai é pelo vector mosquito Aedes aegypti, e, além disso, a transmissão sexual também tem sido relatada 5,6. ZIKV tornou-se um grande problema global de saúde devido à distribuição geográfica expansão do mosquito vetor e sua forte correlação com defeitos de nascimento. ZIKV foi isolado pela primeira vez em 1947 a partir de um macaco rhesus sentinela na floresta Zika, Uganda e o primeiro caso humano foi relatado em 1952 7,8. Indivíduos que se tornam infectados com ZIKV apresentam sintomas leves, como febre, erupção cutânea, dor de cabeça, conjuntivite e dor muscular / conjunta. Mulheres grávidas infectadas podem transmitir ZIKV ao feto em desenvolvimento 1. ZInfecção IKV também tem sido associada à síndrome de Guillain-Barre, um nervo periférico desordem auto-imune desmielinização 9.
O genoma viral consiste Zika de sentido positivo, de cadeia simples molécula de RNA que é cerca de 10,8 quilobases de comprimento. A estrutura do genoma está organizado como 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, com regiões não codificantes (NCR) flanqueando uma região codificadora de proteínas 6. A única poliproteína (3419 aa) é traduzida que é co- e pós-tradução clivada em 10 peptídeos menores. Tanto o 5'NCR e estruturas de haste-laçada 3'NCR RNA desempenham um papel crítico no início do genoma viral tradução e replicação. Os componentes estruturais do genoma são compostas das proteínas da cápside, a membrana, e de envelope. As proteínas não estruturais são essenciais para a replicação do genoma.
Atualmente, estirpes virais Zika são agrupados em três genótipos principais: Oeste Africano, Leste Africano e Asiático 6,10-13. Foi proposto que a linhagem do Leste Africano espalhou para a África Ocidental e Ásia, onde mais tarde evoluiu ainda mais 12. O genótipo asiático é responsável pelos surtos atuais nas Américas. Zika vírus podem ser cultivados em ambos os mosquitos e as células de mamíferos. Fibroblastos dérmicos primários, células dendríticas imaturas, células progenitoras neuronais corticais, células Vero e são susceptíveis a infecções virais Zika 10,14,15. Ambos os tipos I e tipo II interferões têm sido mostrados para restringir o crescimento ZIKV em fibroblastos da pele 15. Os objectivos deste estudo consistem em proporcionar, um protocolo detalhado passo a passo para a produção e o ensaio de genótipo asiática ZIKA estirpe viral PRVABC59 num sistema de cultura de células de mamífero e para demonstrar a utilidade deste sistema de cultura infecciosa como uma plataforma de desenvolvimento de drogas. Este recurso tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de pesquisa viral e neurológica Zika para elucidar ainda mais imecanismos ts da patogénese viral e evolução da virulência do vírus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um protocolo simplificado para a cultura de vírus Zika in vitro é apresentado. As etapas críticas incluindo, identificando pontos finais óptimas para a expansão da cultura de vírus, medindo título, e quantificar a replicação do genoma foram fornecidos. vírus Zika é um patógeno humano, por isso, enquanto manuseamento de agentes infecciosos, procedimentos de biossegurança devem ser rigorosamente seguidas. Uma linha de células de rim de macaco, Vero, foi usado para demonstrar vários ensaios vi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
Riferimenti
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