Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la In Vitro Effetto profilattico di interferoni

Summary

Il virus Zika (ZIKV), un patogeno emergente, è collegato ad anomalie dello sviluppo fetale e microcefalia. La creazione di un efficace sistema di coltura cellulare infettiva è fondamentale per gli studi sulla replicazione di ZIKV e per lo sviluppo di vaccini e farmaci. In questo studio, vengono illustrati e discussi vari saggi virologici relativi alla ZIKV.

Abstract

Zika Virus (ZIKV) è un patogeno emergente che è collegato a anomalie dello sviluppo fetale, come la microcefalia, difetti dell'occhio, e la crescita compromessa. ZIKV è un virus a RNA della famiglia Flaviviridae. ZIKV è trasmesso principalmente dalle zanzare, ma può anche essere diffuso da materna a trasmissione verticale del feto, così come il contatto sessuale. Fino ad oggi, non ci sono trattamenti o vaccini opzioni affidabili per proteggere quelli infettati dal virus. Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare riproducibile, efficace virus Zika infettiva è critico per studiare i meccanismi molecolari di replicazione ZIKV così come farmaci e vaccini sviluppo. A questo proposito, un protocollo che descrive una in vitro Zika sistema di coltura di cellule di mammifero basata virus per virale analisi produzione e la crescita è riportata qui. Dettagli sulla formazione di placche da virus Zika su un monostrato di cellule e saggio di placca per misurare titolo virale sono presentati. cinetica replica genoma viralee doppio filamento di RNA genomici intermedi replicatory sono determinati. Questa piattaforma coltura è stata utilizzata per lo schermo da una libreria di un piccolo gruppo di citochine conseguente identificazione di interferone-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ come inibitori potenti del Zika crescita virale. In sintesi, un infettiva sistema di coltura in vitro Zika virale e vari saggi virologici sono dimostrati in questo studio, che ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca nel chiarire ulteriormente i meccanismi di patogenesi virale e l'evoluzione della virulenza del virus. Antivirale IFN-alfa può essere ulteriormente valutata come un profilattico, profilattico post-esposizione, e opzione di trattamento per le infezioni da virus Zika in popolazioni ad alto rischio, comprese le donne in gravidanza infettate.

Introduction

Zika Virus (ZIKV) è un importante patogeno umano associato con microcefalia e poveri gravidanza esiti ^1,4. ZIKV appartiene alla serie di flavivirus clinicamente rilevanti che possono causare difetti neurologici, come la dengue, West Nile, e virus encefalite di St. Louis. La modalità principale di trasmissione virale è dal vettore zanzara Aedes aegypti, e, inoltre, la trasmissione sessuale è stata riportata anche ^5,6. ZIKV è diventata un importante problema di salute globale a causa della espansione della distribuzione geografica della zanzara vettore e la sua forte correlazione con difetti alla nascita. ZIKV è stato isolato nel 1947 da ....

Protocol

Nota: Un profilo schematico del flusso di lavoro è presentato in Figura 1.

1. cellule

1. Utilizzare cellule Vero per la produzione di virus Zika e l'analisi del ciclo di replicazione virale.
2. Preparare mezzi completi crescita contenente 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 unità / ml), e 10 mM HEPES.
3. Cellule Vero coltura con terreno di coltura completo specificato a 37 ° C con 5% di CO _2.

2. Zika Virus Produzione

1. Raccogliere le cellule Vero a densità cellulare 80% con 0,25% t....

Results

Un ceppo virale Zika (PRVABC59; GenBank numero di accesso KU501215) del genotipo asiatico è stato utilizzato in questo studio ^12. Cellule Vero a 80% di confluenza sono stati usati per indagare de novo Zika infezione virale. Per la produzione virale e la successiva caratterizzazione virologica, un passaggio precoce del virus (P3) Zika è stato impiegato. Sono state rilevate le placche virali il secondo giorno di infezione. Zika progenie virali rilasciate dalla cellula i.......

Discussion

Qui, un protocollo semplificato per la coltura dei virus Zika in vitro è presentato. Passaggi critici tra cui, individuando punti finali ottimali per espandere la cultura del virus, la misurazione titolo, e quantificare replicazione del genoma sono stati forniti. virus Zika è un patogeno umano, così, durante la manipolazione di agenti infettivi, le procedure di biosicurezza devono essere seguite scrupolosamente. Una linea cellulare di rene di scimmia, Vero, è stato utilizzato per dimostrare vari saggi virologic.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s Eagle modificato' (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
2,5% di tripsina, 10x [-] Fenolo rosso	Corning	25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	T10282
Contessa - ndash; Contatore di cellule automatizzato	ThermoFisher Scientific	C10227
Countess-cell countess  vetrini della camera	ThermoFisher Scientific	C10283
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
monoclonale di topo anti-dsRNA anticorpo J2	Italiano & Consulenza Scientifica Kft.
capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fischer	4471088
senza RNasi DNase	Promega	M6101
Vero Cell Line	ATCC	CCL-81
Ceppo virale Zika PRVABC59	Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC)
IL-6	Peprotech	200-06
IL-1 alfa	Peprotech	200-01A
TNF-alfa	Peprotech	300-01A
Interferone alfa A	R & D Systems	11100-1
Interferone beta	Peprotech	300-02BC
Interferone gamma	Peprotech	300-02
Centrifuga 5415R	Eppendorf	5415R
Centrifuga 5810R	Eppendorf	5810R
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