Summary
私たちは、報酬の状態の変化の指標として自主的なエタノール消費を使用して、ミバエ（ キイロショウジョウバエ ）にやりがいとnonrewarding経験を誘導するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
私たちは、報酬の状態の変化のためのプロキシとしてミバエ（ キイロショウジョウバエ ）にエタノール自己投与を測定するためのプロトコルについて説明します。私たちは、ハエの報酬システムを活用自然の報酬に関連した経験を変更し、報酬の状態の変化の指標として自主的なエタノール消費を使用する簡単な方法を示しています。アプローチは、内部状態の経験媒介性変化に役割を果たしニューロンおよび遺伝子を研究するための関連ツールとして機能します。やりがいとnonrewarding経験にハエを露出させ、および薬物報酬を得るために、モチベーションの尺度として自主的なエタノール消費をアッセイ：プロトコルは、2つの別個の部分から構成されます。 2つの部分はそれぞれ、さらに下流のアッセイのための最初のステップとして、または独立した二選択摂食アッセイとして経験の調節を誘導するために独立して使用することができます。プロトコルは、複雑な設定を必要としないため、任意の研究所で適用することができます基本的なフライ培養ツールとyの。
Introduction
経験に応じて、行動の修正は、動物がその環境1の変化に彼らの行動を調整することができます。このプロセスの間、動物は、外部環境の変化する条件で、内部の生理的状態を統合し、その後の生存と再生のチャンスを高めるために、別の上で1つのアクションを選択します。報酬システムは、飲食、またはそのような子孫2のための性行動や思いやりなどの長期生存を確保するものとして、即時の生存率を高める行動を補強することにより、個人および種の生存のために必要とされる行動を動機づけるように進化しました。そのような乱用薬物などの人工化合物はまた、天然の報酬2を仲介共同オプトイン神経経路によって報酬系に影響を与えます。
最後の二十年の間に、果実はキイロショウジョウバエが molecを研究するための有望なモデルとして確立されている飛びますウラルと行動3,4にエタノールの影響を形成している神経メカニズム。
以前、我々は、薬物報酬5を得るための動機に、ハエにおけるペプチド性ニューロンのサブセット（NPF / NPF受容体（R）ニューロン）などの性的経験としてそのカップル自然の報酬を、同定しました。 NPF式は、両方の性的な経験にし、例えば、エタノール中毒などの薬物の報酬に敏感です。 NPF発現レベルの変化は、高NPFが減少し、低NPFがエタノールを消費する設定を増加させ、エタノール自己投与5、の変化に変換されます。彼らはまた、減少したエタノール消費により反射され活性化、とペアになって臭いのための強い好みを表示するようNPFニューロンをアクティブにすると、ハエのためにやりがいのあります。さらに重要なことは、NPFニューロンの活性化は、エタノール中毒と臭気キューとの間に正の関連を形成するハエの能力を妨害します。 NPF / Rとの間の因果関係システム、報酬のメモリ、およびエタノール消費は1つが報酬の状態5の変化の指標としてエタノール自己投与を使用することができることを示唆しています。
この公報では、報酬の状態でフライ自然の報酬システムおよびアッセイの変更を活用するための統合的なアプローチを実証します。アプローチは、報酬の状態の変化の推定値としてエタノール自己投与を評価するために、2つの選択肢のキャピラリーフィーダーアッセイ（CAFE）に続いて2つの部分、自然の報酬関連の経験を操作するための訓練プロトコルで構成されています。 CAFEアッセイは、薬物自己投与のための齧歯類試験で使用される2つのボトルの選択アッセイに類似しており、ハエ6中毒のような動作の特定の特性を反映することが示されています。
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Protocol
注：実験計画の概要：実験計画は、雄ハエが4日間にわたって3回連続トレーニングセッションにやりがいとnonrewarding経験にさらされている求愛抑制7-9のための適応プロトコルが含まれています。 4 - D経験フェーズの終了時に、ハエは3のための2つの選択肢の自発的エタノール消費アッセイで試験されています。他の実験（ 表1）の開始前に適時に行われるべきであるプロトコルは、本明細書中に、複数の実験に使用される事前に行うことができるいくつかのいくつかの準備ステップを含んでいます。
1.準備手順
- 毛細管フィーダシステムの準備
- 27 G針を熱し、バイアル（ 図1）に沿って小さな穴を穿刺するために使用します。
- カミソリの刃を使用して半分（横）にバイアルのプラグをカット。プラグの表面上のマーク4点、squarを作成しますE形は、毛細管ホルダーに位置決めします。プラグ（ 図1b）を介して4つの穴を作るために18 G針を使用してください。
- 彼らはしっかりとアダプタとして機能し、5μLのガラスキャピラリーを、保持することができるように、マイクロピペットをカットするためにカミソリの刃を使用してください。
- 準備されたプラグに4キャピラリアダプタを挿入します。
- プラグ上の2エタノールと2 nonethanol含有毛細血管の位置をマークします。
注：すべてのバイアル間で一貫性の毛細血管の2種類のポジションを維持することが推奨されています。大きな穴がバイアルからハエの脱出を可能にするように、穴の大きさに注意してください。プラグを切断すると、ハエがで絡まことができますいくつかの小さな、緩い繊維を作成するように加えて、バイアルに挿入されたときに下向き側として（通常はカット側の反対側）プラグの滑らかな側面を使用することをお勧めします。 - 毛管フィーダシステム（CAFE）のために使用されるバイアルおよびアダプターを多数準備ステップ2.3で説明した実験。
- 小さなガラス食品バイアルの準備
- 日ハエ（ステップ1.4）を収集する前に、マイクロチューブのラックに200ガラスバイアルを手配。溶融物は、マイクロ波を用い（コーンミール糖蜜レシピに従って、 材料の表を参照）食べ物を飛びます。ガラスバイアル（バイアル壁の上に食べ物を汚すしないようにしてください）に、フライ食品の2ミリリットルを注ぎます。食品の硬化をしてみましょう、とラップでバイアルをカバーしています。
注：食品を含有するガラスバイアルを数週間4℃で保持することができます。 - ハエ収集の日には、冷蔵庫から出しバイアルを取り、彼らはハエを収容するためにそれらを使用する前に、RTに到達させます。
注：食品のバイアルは数週間古い場合は、ハエが食品とガラスとの間の亀裂に捕捉することができるよう食品は、まだ無傷でバイアルから切り離されていないことを確認してください。
- 日ハエ（ステップ1.4）を収集する前に、マイクロチューブのラックに200ガラスバイアルを手配。溶融物は、マイクロ波を用い（コーンミール糖蜜レシピに従って、 材料の表を参照）食べ物を飛びます。ガラスバイアル（バイアル壁の上に食べ物を汚すしないようにしてください）に、フライ食品の2ミリリットルを注ぎます。食品の硬化をしてみましょう、とラップでバイアルをカバーしています。
- 毛細管フィーダーアッセイ用のストック食品のソリューションを作ります
- 事前にするにはストック食品溶液（5％スクロースおよび5％酵母エキス）を削減する、酵母エキス5.88 gの蒸留水100mL中のスクロース5.88グラム溶解します。
注：原液を汚染に非常に傾向があります。したがって、それをオートクレーブすることが推奨（121℃、30分、および乾燥サイクルなし）、アリコート作業850μLにアリコートは、さらなる使用まで4℃で保存されます。ストック溶液中の成分の濃度は5.88％であり、単に、ステップ2.3において、使用前に15％エタノールまたは水（既成食品液850μLに150μL）を加えた後、5％の最終濃度に到達します。
- 事前にするにはストック食品溶液（5％スクロースおよび5％酵母エキス）を削減する、酵母エキス5.88 gの蒸留水100mL中のスクロース5.88グラム溶解します。
- 実験的なハエの収集
- CO 2パッドを使用して200ナイーブ男性のハエを収集します。
注意：実験的な質問に関連する任意の研究室株を使用してください。 250ハエが容易に羽化ピック相におけるハエの5瓶から採取することができます。ハエを収集する場合、列に細心の注意を払います最近eclosedいる択ハエ（バージン-探しハエ：自分の腹部に胎便スポットと明るいハエ）。実験に使用される前に4日齢 - 実験ハエは3に食べ物や高齢者を含む小さなガラスバイアルに単独で維持されるべきです。 - バイアルを閉じるには、ソフトのプラグを使用してください。
注：経験フェーズ中に内外へのバイアルのメスを挿入するために、口の吸引を使用しているときと同じソフトプラグは、トレーニングフェーズのために非常に有用であろう。
- CO 2パッドを使用して200ナイーブ男性のハエを収集します。
- トレーナーのハエの収集
注：すべての収集されたハエは、25℃及び70％相対湿度（RH）で12時間/ 12時間の明/暗インキュベータ中に保持されるべきです。 12時間/ 12時間の明/暗サイクル便利開始時間に変更することができます。- ヴァージン女性トレーナーのハエ
- 500処女の女性トレーナーがWT株や処女受容雌として使用するためのvirginatorストックから飛ぶ収集します。レギュラーサイズの食品バイアル当たり25のグループで女性のハエを維持し、すべての実験でそれらを使用する前に、4日齢 - 3歳にしてOW。
- 交配女性トレーナーのハエ
- 訓練段階（ステップ1.6.1）の前に交配を受けるWT株やvirginatorストックから300処女雌ハエを収集します。
注：女性ハエは、通常のサイズの食品バイアルあたり10人の女性のグループに保管し、3歳されている - 実験に使用される前に4日齢。
- 訓練段階（ステップ1.6.1）の前に交配を受けるWT株やvirginatorストックから300処女雌ハエを収集します。
- 男性ハエは交尾した雌トレーナーのハエを生成するために使用されます
- 150雄のハエ（必ずしも処女）を収集します。
注：ハエは、通常のサイズの食品バイアルあたり15人の男性のグループに保管し、3歳されている - 処女雌は交尾トレーナー雌を作成するために飛ぶと対にされる前の旧4日間。
- 150雄のハエ（必ずしも処女）を収集します。
- ヴァージン女性トレーナーのハエ
- 交配女性トレーナーのハエの生成
- 15男性が女性コンタに1人の男性を含むバイアルを反転することによりハエと交配メスを生成するにはトレーナーとして使用されるように飛ぶ、10処女雌のペアグループが飛びます訓練段階（ステップ2.1）10前に18時間-バイアル16をining。
注：これは、通常のトレーニングセッションの前に夜場所を取る必要があります。 1.5：男性の間の1の比率は、すべての女性が交配されることを保証する女性のハエに飛びます。 - 実験の日に、口の吸引器を使用して、バイアルから男性を吸引することにより、男性から交配した雌を分離します。各訓練日の開始前にこの権利を実行します。
- 15男性が女性コンタに1人の男性を含むバイアルを反転することによりハエと交配メスを生成するにはトレーナーとして使用されるように飛ぶ、10処女雌のペアグループが飛びます訓練段階（ステップ2.1）10前に18時間-バイアル16をining。
2.実験手順
- 経験の位相を設定します
- インキュベーターの光フェーズの開始にできるだけ近い実験を開始します。行動チャンバー内（処女と交配両方）トレーナー女性を配置します。
注：これは、動作チャンバ内の実験、または静かで25℃、60に設定されている任意の人里離れた環境を実行することをお勧めします - 65％RHを。 50％以上の湿度を保つことは求愛と交尾行動するので、非常に重要ですSは湿度に敏感であることが知られているフェロモン感知、に依存します。
- インキュベーターの光フェーズの開始にできるだけ近い実験を開始します。行動チャンバー内（処女と交配両方）トレーナー女性を配置します。
- やりがいとnonrewarding経験に男性のハエを公開します
- ラックの縁に沿ってバイアルを配置する、微量ラック上の単一のオスのハエを含有するガラスバイアルを配置します。
注：この構成は、実験者が簡単にラックからバイアルを取らずに交尾を受けるハエのペアを観察することができます。 - やりがいとnonrewarding交配の経験を受けて、男性用に別のラック（ すなわち拒否され、交配）に飛ぶ（ステップ2.2.1で説明したように）単一の男性を含む100ガラスバイアルの2群準備します。
- 吸引トレーナー雌と雄のハエを含む各バイアルに追加します。 1時間のタイマーを設定します。拒否されたグループから開始し、各バイアルに交配メスを追加します。その後、交配する男性に移動し、各バイアルに処女雌を追加します。
- 密接に嵌合出会いを見ます処女雌との相互作用雄が1時間以内と以前に交配した雌との相互作用雄が交尾しないことを正常にかみ合うことを確認します。 1時間かけて拒否されたコホートを監視するには、15分間の第二のタイマを設定し、男性を15分ごとに監視します。
- 最初のトレーニングセッションの終了により交配を終了しなかった交配集団から拒絶嵌合するように管理さコホート、男性から男性を放電してください。
- 定期的なフライ食品のバイアルに、以前に交配女性トレーナーを吸引することにより、最初のトレーニングセッションを終了し、次のコンディショニングセッションのために保管してください。優しく交配男性グループからメスを吸引することによって、この手順に従ってください。
- ハエは1時間休憩しましょう。
- 二回2.2.7 - を繰り返して、2.2.3を繰り返します。
- さらに3日間毎日2.2.8 - 手順2.2.3でトレーニングセッションを繰り返します。
- ラックの縁に沿ってバイアルを配置する、微量ラック上の単一のオスのハエを含有するガラスバイアルを配置します。
- 録音消費（CAFE）
- 最後conditioninの終わりにグラムセッション（四日）、キャピラリーフィーダーバイアルに単一の男性とのグループにそれらを吸引します。ハエを挿入しながらキャピラリフィーダーバイアルをカバーするために、ソフトプラグを使用し、すべてのハエが挿入された後既製キャピラリー給電プラグをすぐに交換してください。条件ごとに劣ら8以上のバイアルを作成するバイアルに、実験群のそれぞれから8ハエ、 - グループ6。
- 静かにプラグの上部に水5mLを添加することにより、プラグを濡らします。バイアルに流出を避けるために、水を添加しながら注意してください。各バイアルに同量の水を追加します。
注：この手順は、毛細血管からの蒸発を減らすために行われます。したがって、実験の残りのために毎日繰り返されます。相対湿度に応じて、次の日は、プラグに追加するより少ない水を必要とし得ます。 - 15％の最終濃度を作成する在庫食品アリコートにエタノールまたは水を加えることによって、2つの別個の食品溶液を調製します。
- capillを埋めるために、2食のソリューションと牡羊座、5μLを作成する液状食品は、実験用フィルムストリップに低下し、それが5μLマークに達するまで溶液が毛管を充填することを可能にします。 5μLブラックマークラインの近くにある毛細血管の明確な終わりを使用してください。
注： - 一緒に8キャピラリアダプタおよび毛細血管を保持するためにインサートとして使用し、一度に複数のキャピラリーを満たすためには、6を接続することが可能です。 - ブラックマークで正確に食品のソリューションを配置するためにパラフィンストリップ上にそっと毛細血管をタップします。鉱物油の小滴に各キャピラリーの端部を浸漬することによってキャピラリーをシール。このステップでは、食品・ソリューションの潜在的な蒸発を最小限に抑えることができます。
- 毛細血管の露出した側面がかろうじてバイアルの内部（プラグ表面から1mm以下）から覗くまで2エタノール含有毛細血管を挿入し、プラグインの4アダプター/ホルダーを通して毛細血管を含む2 nonethanol。
注意：ぬれたプラグに近い毛細血管の開口部を維持するの蒸発を低減し、ハエが通常のプラグの上に座ると餌にさらさキャピラリーに降りるように、食品に簡単にアクセスできます。 - 実験的なハエが含まれているバイアルに加えて、ハエのないモックバイアルを準備します。このコントロールは、自然蒸発を評価するのに役立ちます。
注：違いは変数蒸発し、消費データを誤解につながることができますように、プラグに比べキャピラリー開口部の比較的同等の位置を維持するようにしてください。実験中に十分な湿度を維持し、湿ったプラグから湿度が低く、大規模な距離として、ぬれたプラグにできるだけ近い毛細血管の開口部を配置制御されていない蒸発の両方の結果をすることができます。 - 定規を使用して、mm単位のブラックマーク線に対して毛細血管のそれぞれの液体の相対的な位置を記録し、これらの値を書き留めます。
注：解決策は、黒リットルに正確に配置されている場合INEは、値はゼロに等しくなければならない、それは上または下である場合、それは、それぞれ、正または負の値であるべきです。液体の初期レベルは、最終的なO / N消費値の基準点を設定します。 - 24時間バックインキュベーターでバイアルを設定します。実験全体を通して一定の時間で毛細血管を交換してください。
- バイアルからそっと毛細血管を外し、黒のマーキング線に対して液体のレベルを測定します。
- モックバイアル内の液体レベルを慎重に確認してください。
注：レベルが2mm以上を落とした場合は、蒸発が高く、消費レベルが信頼できないことを示しています。 - 2.3.10 - 手順2.3.3に示すように、2mLの水で軽く栓を減衰し、毛細血管の新しいセットを挿入します。 24時間バックインキュベーターでバイアルを設定します。
- 決定の好み
- 私から最終レベルを減算することにより、各キャピラリの総消費量を計算します出発点でnitialレベル。
- 同じ食品（エタノール含有毛細血管から別途すなわち nonethanol毛細血管）との両方の毛細血管の値を結合します。
- エタノール含有毛細血管から消費量から非エタノール毛細血管から消費量を減算することにより、エタノールの嗜好を計算し、同じバイアルのすべての毛細血管からの総消費量の値によって値を割ます。
- 同じ実験群のすべてのバイアルの好みのインデックスを平均します。
注：Nonethanol 1（NE1）、Nonethanol 2（NE2）、エタノール1（E1）、エタノール2（E2）、総nonethanol（合計NE）= NE1 + NE2、総エタノール（合計E）は、E1 + E2を=、総合計消費（合計）=合計NE +合計E、およびエタノール選好指数（PI）
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Representative Results
FPreviously、Devineni ら。ショウジョウバエは、エタノール含有食品を摂取するための選択肢が与えられたとき、彼らは食糧6を含むnonethanolオーバーエタノール含有食品に対する強い好みを表示することを示しました。ここに示したトレーニングプロトコルを受けていないナイーブ男性のハエの生来のエタノール嗜好を分析するときに我々が得たいくつかの代表的な結果です。
ナイーブカントンS男性のハエは4日齢まで熟成させ、羽化時に集め、4日間（ 図2）の過程でエタノールを消費する彼らの生得的な好みについてアッセイしました。展示にnonethanol食品の上に15％エタノール食品を消費するための堅牢な嗜好（ 図2）ハエエタノールとnonethanol含有溶液のショーから消費量を分析します。
性的に対向使い方経験は、我々が以前にグループに交尾させた雄のハエは、以前に交配した雌（「拒否-単離された」）によって拒否された単独飼育雄より表示低いエタノール嗜好（「グループ化を交配」）ことを明らかにしました。私たちは、交配に関連した経験から、住宅の経験を切り離すためにいくつかのコントロールを使用し、差動選好が交尾経験5から得られることを示しました。
ここで説明する訓練プロトコルを使用して、我々は単独で交配生成と同様の筐体と相手政権を受けた男性のハエを拒否しました。独身男性カントンSハエは異種交配の経験に4日間にわたって行いました。男性の一コホートは、相互作用して、処女雌ハエ（単交配コホート）と交尾させ、他のコホートは、以前、交尾の雌ハエ（シングル拒否コホート）で訓練を受けました。あちこち訓練段階に続いて、単一の男性2つのコホートにグループ化された（8 /バイアル）およびキャピラリーフィーダバイアルに入れmは、彼らの自発的エタノール消費は、4日間（ 図3A）について記録しました。エタノールを消費する好ましいのは、ステップ2.4において、式（ 図3B）を使用して消費データから算出しました。正の値は、エタノール含有食品に対する好みを示し、負の値は、エタノール含有食品への嫌悪感を示しています。
今回の実験は、その性的な経験を示唆し、我々の以前の発見をサポートし、ない住宅事情、エタノール消費量を調節します。成功した相手は、次にエタノール消費を低下させる内部報酬のレベルを増加させます。報酬の欠如として認識拒絶は、報酬探索行動（ 図3B）の増加につながります。
図2.先天性選好の例は、エタノールを消費します。ナイーブWT雄、8人の男性/バイアルのグループにグループ化し、そしてエタノール及びnonethanol含有溶液の消費は、96時間にわたって記録しました。ハエは、15％エタノールcontaininの大量消費しましたG食品（ボンフェローニ事後検定で** P <0.01、*** P <0.001、双方向の反復測定ANOVA、N = 8）。 SEM - 示したデータは平均+ SEMまたは平均値です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.反対側の交尾経験mModulateエタノール好み。組み合わせプロトコルの（A）の回路図。単一処女WTの男性は処女雌と交尾することが許可されているか（「R」として示されている）、残りの1時間だけ離れた（「T」として示されている）1時間求愛抑制トレーニングセッションを3倍に供されています。訓練は、4日間繰り返します。毎日の終わりには、ハエをインキュベーター（「ON」として示される）に配置されます。訓練の4日後、男性はどこから供給するように選択することができバイアルに入れました15％エタノールを含むまたは含まない食品溶液を含むキャピラリー。 （B）シングル男性は、単一の交配男性（より高いエタノールの嗜好を示し拒否** P <0.01、双方向のボンフェローニ事後テストと反復測定ANOVA、N = 9は、比較は終了後3日間全体での治療群の間にありますトレーニング）。 SEM - 示したデータは平均+ SEMまたは平均値です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| リファレンスセクション | ノート |
| 1.1 | 多くの実験で使用することができます |
| 1.2 | 数週間のために4℃に保つことができます |
| 1.3 | オートクレーブ後に4°Cで保管してください |
| 1.4 | 前4日 - 3歳実験に使用されています |
| 1.5 | このステップは、各トレーニングセッションの前に夜場所を取る必要があります |
| 2.1 | このステップは、各トレーニングセッションの朝行われるべきです |
| 2.2 | 4日間にわたって3回連続のトレーニングセッションで繰り返されるために、 |
| 2.3 | 水とプラグをダンプ、消費電力を測定し、4日間かけて毛細血管を置き換えます |
| 2.4 | このステップでは、2つの選択肢のアッセイ中の毛細血管を交換する前に毎回行われます |
表1.異なるステップのための順序や時間の流れを描いたプロトコルの概要。
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Acknowledgments
我々は長期的な議論や技術的助言のためにU. HeberleinとA. Devineniに感謝します。我々はまた、方法を実証するとヘルプは、Shohat-オフィールラボメンバー、A. Benzur、L. Kazaz、およびO.シャロームに感謝します。特別な感謝は、ラボでのフライ・システムを確立するためのエリエゼルCostiに行きます。この作品は、イスラエル科学財団（14分の384）とマリー・キュリーのキャリアの統合補助金（CIG 631127）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene 25 x 95 mm Vials | FlyStuff | 32-109 | |
| narrow plastic vials flugs | FlyStuff | 42-102 | |
| Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G | can be acquired by any company | 1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2") | |
| 10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes | kimble chase | 73500-1075 | |
| calibrated pipets 5 μL | VWR | 53432-706 | color coded white to contain 5 μL |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Sucrose, Molecular Biology Grade | CALBIOCHEM | 573113 | |
| Yeast extract Powder for microbiology | can be acquired by any company | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | |
| standard pipette Tips (micro-pipetts) | ThermScientific | T114R-Q | volume: 0.1 - 20 μL (ultramicro) |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-A | fits opening 6 - 13 mm |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-D | fits opening 35 - 45 mm |
| virginator fly stock | bloomington drosophila stock center | #24638 | |
| Narrow Vials, Tray Pack (PS) | Genesee Scientific Corporation | # 32-109BR | |
| Drosophila Media Recipes and Methods | Bloomington Drosophila Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm | |
| propionic acid | Sigma-Aldrich | P5561 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Methl 4-Hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H3647 | |
| Agar Agar | can be acquired by any company | ||
| corn meal | can be acquired by any company | ||
| Grandma's molasses | B&G Foods, Inc | not indicated | |
| instant dry yeast | can be acquired by any company |
References
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