Engineering Molecular Recognition med Bio-mimetiske Polymers på enkelt Walled karbonnanorør
Summary
We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.
Abstract
Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.
Introduction
Single-vegger karbon nanorør (SWNTs) er atomically tynne lag av karbonatomer rullet inn i lange, tynne sylindere som viser unike elektroniske og optiske egenskaper. 1 Slike egenskaper inkluderer et band-gap produserer nær infrarød (NIR) fluorescensemisjonsmaksimum via exciton rekombinasjon som er svært følsom for sitt nærmiljø. NIR utslipp av SWNTs faller innenfor det nære infrarøde vindu hvor inntrengningsdybden av lys er maksimal for biologisk vev. 2,3 I tillegg SWNTs inneha flere unike funksjoner atypiske i motsetning til organiske fluorophores: SWNT utstillingen en stor Stokes skift, ikke photobleach, og ikke blinke. 4 Nylig utnytte disse egenskapene har ført til utviklingen av et utvalg av nye molekylære sensorer med anvendelser til biologi. 5,6 Umodifisert imidlertid SWNTs er uløselige i vann, og få suspensjoner av enkelt SWNTs kan være en utfordring. 7,8 Bundling og aggregering av SWNTs i løsningen kan obfuscate deres band-gap fluorescens, 2 gjør dem uegnet for sensing applikasjoner.
Dispergere individuelle karbon nanorør i vandig løsning krever modifisere deres overflate for å hindre hydrofobisitet-drevet aggregering. 9 Mens kovalent modifikasjon kan gjengi SWNTs vannløselig, 10 samt formidle spesifikk binding kjemi, defekt områder i SWNT gitter redusere eller forringe deres fluorescens utslipp. I stedet kan SWNT funksjonalisering oppnås ved hjelp av overflateaktive midler, lipider, polymerer og DNA 9,11 – 13 som adsorberer til det nanorør overflaten gjennom hydrofobe og pi-pi stabling interaksjoner. Den resulterende kjemiske miljøet rundt overflatefunksjonalis SWNTs blir referert til som den korona fase. Forstyrrelser til koronaen fase kan ha en stor innvirkning på excitons reiser på nanorør overflaten, forårsaker modulasjoner til SWNT fluorescence utslipp. Det er dette følsomme forholdet mellom korona-fase og SWNT fluorescens som kan utnyttes for å utvikle nye molekylære sensorer ved inkorporering av spesifikke bindingsformer på det store overflatearealet av SWNT. Perturbasjoner til SWNT korona-fase ved binding analytten kan føre til endringer i den lokale dielektriske omgivelser, ladningsoverføring, eller introdusere gitterfeil, som alle kan modulerer fluorescensemisjonen av SWNTs for å tjene som en signaltransduksjon mekanisme. 14 Denne fremgangsmåten anvendes i utviklingen av nye fluorescerende sensorer for påvisning av mange forskjellige klasser av molekyler, inkludert DNA, 15,16 glukose 17 og små molekyler som ATP, 18 reaktive oksygenforbindelser 19 og nitrogenoksid. 20,21 Imidlertid er disse fremgangsmåter begrenset ved at de er avhengige av at det foreligger en kjent bindende modalitet for målanalytten.
Nylig har en mer generell appmort å designe fluorescerende sensorer er utviklet ved hjelp SWNTs ikke-kovalent functionalized med amfifile heteropolymerer, fosfolipider, og polynucleic syrer. Disse molekylene adsorberes til karbon nanorør overflater for å produsere svært stabile suspensjoner av enkelt SWNTs 22 – 25 med unike korona faser som spesifikt binder proteiner 26,27 eller små molekyler inkludert signalstoffet dopamin. 28. – 30. Engineering korona-fase for å dispergere SWNTs og spesifikt binder målanalytter betegnes som korona-fase molekylær gjenkjennelse (CoPhMoRe). 28 Den lille størrelsen, lav toksisitet, høy stabilitet og unbleaching NIR fluorescens av CoPhMoRe SWNT sensorer gjør dem gode kandidater for in vivo sensing i lengre tids løst målinger. 6 Nyere arbeider har vist sine søknader i plantemateriale for optisk deteksjon av reaktive nitrogen og oksygen arter. 31En spesielt praktisk anvendelse for CoPhMoRe SWNT følere er potensialet for etiketten fri påvisning av neurotransmittere, slik som dopamin in vivo, hvor andre teknikker, for eksempel elektrokjemisk føle eller immunhistokjemi, lider av en mangel på romlig oppløsning, tidsmessig oppløsning, og spesifisitet.
Prosjektering og oppdage CoPhMoRe SWNT sensorer har så langt vært tilbakeholdne med størrelsen og kjemiske mangfold av dispergeringsmiddel biblioteket, noe som begrenser sannsynligheten for å finne en sensor for et bestemt mål. Hittil har forskerne bare riper i overflaten av tilgjengelig konjugert, co-blokk, biologisk og biomimetic polymerer som kan tjene som funksjonelt aktive dispergeringsmidler for SWNT sensorer. Her presenterer vi ulike metoder for både å spre SWNTs og karakterisere deres fluorescens for high throughput screening og for enkelt SWNT sensor analyse. Spesielt vi skissere fremgangsmåten for belegg SWNTs med polynucleic syre oligomers bruke direkte ultralyd samt hvordan å functionalize SWNT med amfifile polymerer gjennom surfaktant utveksling ved dialyse. Vi bruker (GT) 15-DNA og polyetylenglykol funksjonalisert med rhodaminisotiocyanat (RITC-PEG-RITC) som eksempler. Vi viser bruken av (GT) 15-DNA SWNTs som et CoPhMoRe sensor for deteksjon av dopamin. Til slutt, skissere vi rutiner for å utføre enkle molekylet sensormålinger, som kan brukes for å karakterisere eller enkelt molekyl sensing.
Protocol
Representative Results
Discussion
SWNTs kan lett suspenderes i vandig oppløsning via direkte sonikering med SDS eller ssDNA, som indikert ved en økning i optisk tetthet gitt av den kolloidale dispersjon av det resulterende SWNT-polymer hybrid. SDS og ssDNA sprer og solubiliserer bunter av SWNTs ved å absorbere på SWNT overflaten gjennom hydrofobe eller pi-pi interaksjoner. I tillegg kan andre polymerer, slik som genomisk DNA, amfifile polymerer, konjugerte polymerer og lipider, kan adsorberes på overflaten av SWNTs ved dialyse av prøvene suspender…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.
Materials
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100k Da spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2d array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1d sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| wellplates (glass bottom) | Corning | 4580 |
Riferimenti
- Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. . Carbon Nanotubes. 80, (2001).
- O’Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
- Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
- Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
- Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
- Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
- Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
- Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes–the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
- Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
- Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
- Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
- Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
- Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
- Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
- Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
- Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
- Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
- Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
- Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
- Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
- Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
- Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
- Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
- Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
- Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241 (2016).
- Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
- Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
- Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
- Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
- Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
- Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
- Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
- Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).
