Ingeniería Molecular Recognition con polímeros biomiméticos en una sola pared nanotubos de carbono
Summary
We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.
Abstract
Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.
Introduction
Los nanotubos de carbono de pared simple (SWNT) son atómicamente delgadas capas de átomos de carbono laminados en cilindros largos y delgados que exhiben propiedades electrónicas y ópticas únicas. 1 Tales propiedades incluyen una producción cercano (NIR) la emisión infrarroja de fluorescencia a través de recombinación de excitones que es altamente sensible a su entorno local de intervalo de banda. La emisión NIR de SWNT cae dentro de la ventana de infrarrojo cercano en el que la profundidad de penetración de la luz es máxima para el tejido biológico. 2,3 Además, los nanotubos exhiben varias características únicas atípicos en contraste con fluoróforos orgánicos: SWNT exhiben un gran desplazamiento de Stokes, no photobleach, y no parpadean. 4 Recientemente, la explotación de estas características se ha llevado al desarrollo de una variedad de sensores moleculares novedosas con aplicaciones a la biología. 5,6 sin modificar, sin embargo, SWNT son insolubles en agua, y la obtención de suspensiones de SWNT individuales puede ser un desafío. 7,8 Bundling y la agregación de los nanotubos en solución pueden ocultar su fluorescencia banda prohibida, 2 haciéndolos inadecuados para aplicaciones de detección.
La dispersión de los nanotubos de carbono individuales en solución acuosa requiere la modificación de su superficie para evitar la agregación hidrofobicidad impulsada. 9 Si bien la modificación covalente puede hacer que los nanotubos soluble en agua, 10, así como impartir la química de unión específica, los sitios con defectos en la red cristalina de SWNT reducen o reducir su emisión de fluorescencia. En su lugar, SWNT funcionalización se puede lograr mediante el uso de tensioactivos, lípidos, polímeros y ADN 9,11 – 13 que se adsorben a la superficie de nanotubos a través de interacciones de apilamiento hidrófobos y pi-pi. El ambiente químico resultante que rodea SWNT funcionalizados en la superficie se conoce como la fase de corona. Las perturbaciones a la fase de corona pueden tener un gran impacto en los excitones que viajan sobre la superficie de nanotubos, causando modulaciones a SWNT fluorEscence emisión. Es esta relación sensible entre la fase de corona y la fluorescencia SWNT que puede ser explotado para desarrollar nuevos sensores moleculares mediante la incorporación de modalidades de unión específicos a la gran área de superficie de SWNT. Las perturbaciones a la fase de corona SWNT sobre analito de unión pueden dar lugar a cambios en el entorno dieléctrico local, transferencia de carga, o introducir defectos en la red, todos los cuales pueden modular la emisión de fluorescencia de los SWNT para servir como un mecanismo de transducción de señales. 14 Este enfoque se utiliza en el desarrollo de sensores fluorescentes novedosos para la detección de muchas clases diferentes de moléculas de ADN incluyendo, 15,16 glucosa 17 y moléculas pequeñas tales como ATP, 18 especies reactivas de oxígeno 19 y el óxido nítrico. 20,21 Sin embargo, estos enfoques están limitados en que se basan en la existencia de una modalidad de unión conocida para el analito objetivo.
Recientemente, una aplicación más genéricaRoach para el diseño de sensores fluorescentes se desarrolló utilizando SWNT funcionalizados de forma no covalente con heteropolímeros anfifílicos, fosfolípidos y ácidos polinucleicos. Estas moléculas se adsorben a las superficies de nanotubos de carbono para producir suspensiones altamente estables de SWNT individuales 22 – 25 con fases de corona únicas que pueden unirse específicamente a las proteínas 26,27 o pequeñas moléculas que incluyen el neurotransmisor dopamina. 28 – 30 Ingeniería de la fase de corona para dispersar los nanotubos y específicamente analitos diana se unen se conoce como fase de reconocimiento molecular de corona (CoPhMoRe). 28 El pequeño tamaño, baja toxicidad, alta estabilidad y unbleaching fluorescencia de sensores NIR CoPhMoRe SWNT los hacen excelentes candidatos para la detección in vivo para las mediciones de tiempo de resolverse prolongados. 6 Trabajos recientes han demostrado sus aplicaciones en tejidos de la planta para la detección óptica de las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno. 31Una aplicación particularmente interesante para los sensores CoPhMoRe SWNT es el potencial para la detección sin etiqueta de neurotransmisores tales como la dopamina in vivo, donde otras técnicas, tales como un sensor electroquímico o inmunohistoquímica, sufren de una falta de resolución espacial, la resolución temporal, y especificidad.
El diseño y el descubrimiento de sensores CoPhMoRe SWNT ha sido hasta ahora restringido por el tamaño y la diversidad química de la biblioteca dispersante, lo que limita las posibilidades de encontrar un sensor para un objetivo particular. Hasta la fecha, los investigadores sólo han arañado la superficie de conjugado disponibles, co-bloque, biológica y polímeros biomiméticos que podrían servir como dispersantes funcionalmente activas para sensores de SWNT. A continuación, presentamos diferentes métodos tanto para la dispersión de los nanotubos y la caracterización de su fluorescencia de cribado de alto rendimiento para el análisis y el único sensor de SWNT. Específicamente, se describe el procedimiento para los nanotubos de pintura, haciendo oligom ácido polinucleicoERS mediante sonicación directa, así como la forma de funcionalizar SWNT con polímeros anfifílicos a través del intercambio de surfactante mediante diálisis. Utilizamos (GT) 15-DNA y polietilenglicol funcionalizado con isotiocianato de rodamina (RITC-PEG-RITC) como ejemplos. Se demuestra el uso de (GT) 15 -ADN SWNT como un sensor CoPhMoRe para la detección de la dopamina. Por último, se describe procedimientos para realizar mediciones de sensor molécula individuales, que se pueden utilizar para la caracterización o la detección de moléculas individuales.
Protocol
Representative Results
Discussion
SWNT se suspenden fácilmente en solución acuosa a través de sonicación directa con SDS o ssDNA, como se indica por un aumento en la densidad óptica proporcionada por la dispersión coloidal del híbrido SWNT-polímero resultante. SDS y ssDNA dispersa y solubiliza haces de SWNT por adsorción sobre la superficie de SWNT a través de interacciones hidrofóbicas o pi-pi. Adicionalmente, otros polímeros, tales como ADN genómico, polímeros anfifílicos, polímeros conjugados y los lípidos, pueden ser adsorbidos sobr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.
Materials
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100k Da spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2d array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1d sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| wellplates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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