Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio
Summary
We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.
Abstract
Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.
Introduction
nanotubi a parete singola di carbonio (SWNT) sono atomicamente sottili strati di atomi di carbonio arrotolati in lunghe, sottili cilindri che esibiscono uniche proprietà elettroniche e ottiche. 1 Tali proprietà includono una band-gap produzione vicino (NIR) emissione di fluorescenza a raggi infrarossi tramite ricombinazione eccitone che è molto sensibile al suo ambiente locale. L'emissione NIR di SWNTs rientra nella finestra del vicino infrarosso in cui la profondità di penetrazione della luce è massima per tessuto biologico. 2,3 Inoltre, SWNTs esibiscono diverse caratteristiche uniche atipiche in contrasto con fluorofori organici: SWNT mostra un grande spostamento di Stokes, non photobleach, e non lampeggiano. 4 Recentemente, sfruttando queste caratteristiche ha portato allo sviluppo di un assortimento di sensori molecolari con applicazioni alla biologia. 5,6 non modificato, tuttavia, SWNTs sono insolubili in acqua, e ottenendo sospensioni di singole SWNTs può essere una sfida. 7,8 Bundling e aggregazione di SWNTs in soluzione possono offuscare la loro fluorescenza band-gap, 2 rendendoli adatti per applicazioni di rilevamento.
Disperdendo i singoli nanotubi di carbonio in soluzione acquosa richiede di modificare la loro superficie per impedire l'aggregazione idrofobicità-driven. 9 Mentre modificazione covalente può rendere SWNTs idrosolubile, 10 nonché impartire specifica chimica di legame, siti di difetti nel reticolo SWNT ridurre o abate loro emissione di fluorescenza. Invece, SWNT funzionalizzazione può essere realizzato utilizzando tensioattivi, lipidi, polimeri e DNA 9,11 – 13 che adsorbono alla superficie nanotubo attraverso interazioni idrofobiche e impilamento pi-pi. L'ambiente chimico risultante circostante SWNTs superficie funzionalizzato viene indicato come sua fase corona. Perturbazioni alla fase corona possono avere un grande impatto sul eccitoni che viaggiano sulla superficie di nanotubi, causando modulazioni di SWNT Fluorescence emissioni. E 'questo rapporto sensibile tra la fase della corona e la fluorescenza SWNT che può essere sfruttato per sviluppare nuovi sensori molecolari incorporando modalità specifiche vincolanti sulla grande superficie di SWNT. Perturbazioni alla fase corona SWNT upon analita legame può portare a cambiamenti nell'ambiente dielettrico locale, caricare trasferimento, o introdurre difetti reticolari, ognuno dei quali può modulare l'emissione di fluorescenza dei SWNTs per servire come meccanismo di trasduzione del segnale. 14 Questo approccio viene utilizzato nello sviluppo di sensori fluorescenti innovative per la rilevazione di diverse classi di molecole compreso DNA, 15,16 glucosio 17 e piccole molecole come ATP, 18 specie reattive dell'ossigeno 19 e di ossido nitrico. 20,21 Tuttavia, questi approcci sono limitate dal fatto che essi si basano sull'esistenza di una modalità di legame noto per l'analita bersaglio.
Recentemente, una applicazione più genericoRoach per la progettazione di sensori fluorescenti è stato sviluppato utilizzando SWNTs non covalente funzionalizzati con eteropolimeri anfifilici, fosfolipidi e acidi polynucleic. Queste molecole aderire a superfici di nanotubi di carbonio per la produzione di sospensioni altamente stabili di singoli SWNTs 22 – 25 con fasi corona uniche che possono specificamente legano le proteine 26,27 o piccole molecole, tra cui il neurotrasmettitore dopamina. 28 – 30 Ingegneria fase corona per disperdere SWNTs e specificamente analiti target si legano si riferisce al riconoscimento molecolare fase come corona (CoPhMoRe). 28 Le piccole dimensioni, bassa tossicità, elevata stabilità e unbleaching Nir fluorescenza dei sensori CoPhMoRe SWNT li rendono ottimi candidati per il rilevamento in vivo per misure risolte nel tempo prolungati. 6 Studi recenti hanno dimostrato le loro applicazioni nei tessuti vegetali per la rilevazione ottica di specie reattive di ossigeno e azoto. 31Un'applicazione particolarmente interessante per i sensori CoPhMoRe SWNT è il potenziale per l'etichetta Free Detection di neurotrasmettitori come la dopamina in vivo, dove altre tecniche, come ad esempio il rilevamento elettrochimico o immunoistochimica, soffrono di una mancanza di risoluzione spaziale, risoluzione temporale, e la specificità.
Progettazione e scoprendo sensori CoPhMoRe SWNT è stato finora trattenuto dalle dimensioni e chimica diversità della biblioteca disperdente, limitando la probabilità di trovare un sensore per un particolare bersaglio. Fino ad oggi, i ricercatori hanno solo scalfito la superficie di coniugato disponibile, co-block, biologiche e polimeri biomimetici che potrebbero servire come disperdenti funzionalmente attivi per sensori SWNT. Qui, vi presentiamo diversi metodi sia per disperdere SWNTs e caratterizzare la loro fluorescenza per lo screening ad alto rendimento e per singola analisi sensore SWNT. In particolare, si delineano la procedura per SWNTs vernicanti oligom acido polynucleicERS utilizzando sonicazione diretta così come il modo di funzionalizzare SWNT con polimeri anfifilici attraverso lo scambio tensioattivo con la dialisi. Usiamo (GT) 15 -DNA e polietilene glicole funzionalizzata con rodamina isotiocianato (RITC-PEG-RITC) come esempi. Dimostriamo l'uso di (GT) 15 -DNA SWNTs come un sensore CoPhMoRe per il rilevamento della dopamina. Infine, si delineano procedure per eseguire misure dei sensori molecola singoli, che possono essere utilizzate per la caratterizzazione o singola rilevamento molecola.
Protocol
Representative Results
Discussion
SWNTs sono prontamente sospesi in soluzione acquosa tramite sonicazione diretta con SDS o ssDNA, come indicato da un aumento della densità ottica forniti dalla dispersione colloidale della risultante ibrido SWNT-polimero. SDS e ssDNA disperde e solubilizza fasci di SWNT assorbendo sulla superficie SWNT attraverso interazioni idrofobiche o pi-pi. Inoltre, altri polimeri, come DNA genomico, polimeri anfifilici, polimeri coniugati e lipidi, possono essere adsorbiti sulla superficie del SWNTs mediante dialisi di campioni s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.
Materials
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100k Da spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2d array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1d sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| wellplates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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