We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.
Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.
Enkelwandige koolstof nanobuizen (SWNT) zijn atomair dunne lagen koolstofatomen gerold in lange, dunne cilinders die unieke elektronische en optische eigenschappen. 1 Dergelijke eigenschappen zijn een band-gap productie van nabij-infrarood (NIR) fluorescentie-emissie via exciton recombinatie dat zeer gevoelig is voor de lokale omgeving. Het nabij infrarood emissie van SWNT valt in het nabije infrarood venster waarin de indringdiepte van licht maximaal is voor biologisch weefsel. 2,3 Daarnaast SWNTs vertonen een aantal unieke kenmerken atypische in tegenstelling tot organische fluoroforen: SWNT vertonen een grote Stokes verschuiving, niet photobleach en niet knipperen. 4 Onlangs exploitatie van deze kenmerken heeft geleid tot de ontwikkeling van een assortiment van nieuwe moleculaire sensoren met toepassingen in de biologie. 5,6 Ongewijzigde echter SWNTs zijn niet oplosbaar in water, en het verkrijgen van suspensies van de individuele SWNTs kan een uitdaging zijn. 7,8 Bundling en aggregatie van SWNTs in oplossing kunnen hun band-gap fluorescentie, 2 verdoezelen waardoor ze ongeschikt zijn voor sensing-toepassingen.
Dispergeermiddelen individuele koolstof nanobuisjes in een waterige oplossing vereist het wijzigen van hun oppervlak te hydrofobiciteit gedreven aggregatie te voorkomen. 9 Terwijl covalente modificatie SWNT kunnen wateroplosbaar, 10 en geven specifieke binding chemie, defectlocaties in de SWNT rooster verminderen of verminderen hun fluorescentie-emissie. In plaats daarvan kunnen SWNT functionalisering worden bereikt door gebruik surfactanten, lipiden, polymeren en DNA 9,11 – 13 die adsorberen aan de nanobuis oppervlak met hydrofobe en pi-pi interacties stapelen. De resulterende chemische omgeving rond het oppervlak gefunctionaliseerde SWNT's wordt aangeduid als de corona fase. Verstoringen van de corona fase kan een grote impact hebben op excitonen reizen op de nanobuis oppervlak, waardoor modulaties tot SWNT fluorescence emissie. Hierdoor gevoelige relatie tussen de corona fase en SWNT fluorescentie die kan worden benut om nieuwe moleculaire detecterende sensoren door specifieke binding modaliteiten op het grote oppervlak van SWNT. Verstoringen de SWNT corona fase na binding analyt kan leiden tot veranderingen in de lokale omgeving diëlektrische, ladingsoverdracht of invoeren roosterfouten, die allemaal kunnen de fluorescentie-emissie van de SWNT moduleren om te dienen als een signaaltransductie mechanisme. 14 Deze werkwijze wordt gebruikt bij de ontwikkeling van nieuwe fluorescerende sensoren voor de detectie van vele verschillende klassen van moleculen zoals DNA, 15,16 glucose 17 en kleine moleculen zoals ATP, 18 reactieve zuurstofdeeltjes 19 en stikstofoxide. 20,21 Echter, deze methoden beperkt doordat ze vertrouwen op het bestaan van een bekend bindend modaliteit voor het doelanalyt.
Onlangs, een meer algemene appvoorn het ontwerpen fluorescerende sensoren is ontwikkeld met SWNT niet- covalent gefunctionaliseerd met amfifiele heteropolymeren, fosfolipiden en polynucleïnezuren. Deze moleculen adsorberen aan koolstof nanobuis oppervlakken zeer stabiele suspensies van de individuele SWNTs 22 produceren – 25 met unieke corona fasen die specifiek proteïnen 26,27 of kleine moleculen, met inbegrip van de neurotransmitter dopamine kan binden. 28-30 Techniek de corona fase SWNTs en specifiek binden doelanalyten dispergeren wordt genoemd corona fase moleculaire herkenning (CoPhMoRe). 28 Het kleine formaat, lage toxiciteit, hoge stabiliteit en unbleaching nabij infrarood fluorescentie van CoPhMoRe SWNT sensoren maken ze uitstekende kandidaten voor in vivo sensing voor langere tijdsopgeloste metingen. 6 Recent werk heeft hun toepassingen in plantenweefsels getoond voor optische detectie van reactieve stikstof en zuurstof soorten. 31Een bijzonder interessante toepassing voor CoPhMoRe SWNT sensoren bestaat op label vrij detecteren van neurotransmitters zoals dopamine in vivo, waar andere technieken, zoals elektrochemische detectie of immunohistochemie, lijdt aan een gebrek aan ruimtelijke resolutie, temporele resolutie en specificiteit.
Het ontwerpen en het ontdekken CoPhMoRe SWNT sensoren tot dusver beperkt door de grootte en chemische diversiteit van de bibliotheek dispergeermiddel, beperkt de kans op het vinden van een sensor voor een bepaald doel. Tot op heden hebben onderzoekers alleen oppervlakkig beschikbare geconjugeerd, co-block, biologische en biomimetische polymeren die als functioneel actieve dispergeermiddelen voor SWNT sensoren kan dienen. Hier presenteren we verschillende methoden voor zowel het verspreiden SWNTs en karakteriseren van hun fluorescentie voor high throughput screening en voor alleenstaande SWNT sensor analyse. In het bijzonder, we een overzicht van de procedure voor het coaten van SWNTs met polynucleïnezuur oligomers met behulp van directe sonicatie alsmede hoe SWNT met amfifiele polymeren te functionaliseren door middel van oppervlakte-actieve uitwisseling door middel van dialyse. Wij gebruiken (GT) 15 -DNA en polyethyleenglycol gefunctionaliseerd met rhodamine-isothiocyanaat (RITC-PEG-RITC) als voorbeeld. We demonstreren het gebruik van (GT) 15 -DNA SWNT als CoPhMoRe sensor voor de detectie van dopamine. Tenslotte beschrijven we procedures voor het uitvoeren van individuele moleculen sensormetingen, die kan worden gebruikt voor de karakterisering of single molecule detectie.
SWNT's worden gemakkelijk gesuspendeerd in waterige oplossing via directe sonicatie met SDS of ssDNA, zoals aangegeven door een toename van de optische dichtheid door de colloïdale dispersie van de resulterende SWNT-hybride polymeer. SDS en ssDNA verspreidt en oplosbaar bundels van SWNTs door adsorberen op de SWNT oppervlak door middel van hydrofobe of pi-pi interacties. Bovendien, andere polymeren, zoals genomisch DNA, amfifiele polymeren geconjugeerde polymeren en lipiden, worden op het oppervlak van SWNT geadsor…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.
sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
100k Da spin filters | Millipore | ||
HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
periscope | ThorLabs | RS99 | |
immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
infrared 2d array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
infrared 1d sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
wellplates (glass bottom) | Corning | 4580 |