Summary
Een eenvoudige rode bloedcel lysis methode voor het vaststellen van B-LCL werd ontwikkeld met hoge efficiency immortalisatie, die een kleine hoeveelheid bloed en tijdsbesparing van initiatie tot cryopreservatie.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituut voor Genetica en Developmental Biology, en het protocol volgt de institutionele richtlijnen voor het menselijk welzijn.
1. Bereiding van EB Virus
- Op dag 1, ontdooien B95-8 cellen en kweek in 6 ml compleet RPMI 1640 medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine en antibiotica (100 pg / ml streptomycine, 100 U / ml penicilline) in een T25 kolf. Plaats de kolf in 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Op dag 2, acht de cel morfologie onder een microscoop. Cellen zijn in goede conditie als ze zijn licht en rond. Voeg 10 ml compleet RPMI 1640 medium.
- Op dag 4, voeg 10 ml vers compleet RPMI 1640 medium, en vervolgens over een T75 kweekfles.
- Op dag 8, voeg 20 ml compleet RPMI 1640 medium.
- Handhaaf de cellen gedurende 8 dagen zonder toevoeging van vers medium, dat wil zeggen, verhongering.
- Op dag 16, acht cellenWaargenomen onder de microscoop. Verzamel de cellen in een 15 ml centrifugebuis, 12 ml / buis.
- Cryo-behouden bij -80 ° C gedurende 1 uur, en vervolgens snel ontdooien bij 37 ° C. Herhaal 3 totdat het virusdeeltjes vrijkomen uit de cellen.
- Centrifugeer bij 240 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,22 urn filter, portie, 12 ml / buisje en bewaar bij -80 ° C.
2. Behandeling van volbloed met rode bloedcel lysisbuffer
- Voeg 0,5 ml volbloed antistolling door EDTA · K 2 tot 15 ml buis.
- Zet 1 ml rode bloedcellen lysis buffer (gefiltreerd door 0,22 urn filter en ontdooid tot kamertemperatuur vóór gebruik) het bloed en meng goed. Plaats het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 min. snel 7 ml 1x PBS aan de aanslag reactie - voeg dan 5.
- Centrifugeer bij 240 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Witte bloedcellen neerslaan op de bodem van de buis.
- Verwijder het supernatant, en was de neerslag door toevoeging van 7 ml 1640 basisch medium. Centrifugeer 5 min bij 240 xg bij kamertemperatuur. Herhaal dit twee keer.
- Resuspendeer de celpellet in 300 ul transformatie medium (RPMI 1640 medium dat 20% foetaal runderserum en 10 pg / ml fytohemagglutinine (PHA)).
3. EBV-infectie
- Voeg 60 ul van 20 ug / ml cyclosporine A (CsA) aan de celsuspensie.
- Snel ontdooien een hoeveelheid EBV bij 37 ° C. Voeg 240 ul EBV aan de celsuspensie.
- Meng goed en zet de celsuspensie op een 96-well plaat, 200 ul per putje. Verdamping plaatsvindt, voeg 200 ul 1x PBS aan elke well wordt rond de 96-well plaat. Plaats de plaat in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
4. Uitbreiding en cryopreservatie van B-LCL
- Verander de helft van het medium eenmaal per week gedurende de eerste maand na EBV infectie. Alleen een dikke layer uit celfragmenten zichtbaar onder de microscoop op dag 7 (Figuur 2). Na een maand van EBV infectie lymfoblastoïde celclusters zichtbaar onder een dikke laag celfragmenten onder de microscoop (Figuur 2).
- Verander de helft van het medium om de 3 dagen tot de celgroepen duidelijk zichtbaar onder de microscoop (Figuur 2). Meestal is dit proces duurt 10 tot 20 dagen.
- Na mengen Pipetteer de cellen en overbrengen naar de 24-well plaat. Het dubbele van het volume van het kweekmedium met volledig RPMI 1640, terwijl het geel wordt. Dit proces is afhankelijk van de snelheid van celgroei.
- Vervolgens brengen de cellen T25 kweekfles. Het dubbele van het volume van het kweekmedium zo blijkt gele totdat het volume van het medium uit tot 10 - 15 ml.
- Verander medium 24 uur voor het invriezen. Centrifugeer celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 x g. Aantal cellen met een celteller en bevriezen bij een dichtheid van 5-10 x 10 6 / mL in frozen voorraadoplossing die 90% FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Invriezen bij een snelheid van 1 ° C per minuut tot -80 ° C en breng onmiddellijk in vloeibare stikstof.
5. 3- (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay 17
- Bereid een B-LCL enkele celsuspensie met 1640 medium dat 10% foetaal runderserum. Zaad 3 x 10 4 cellen per putje op 96-well plaat, 100 ul per putje.
- Plaats de plaat in 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 12-16 uur.
- Voeg MTT (5 mg / ml) aan putjes die cellen groeien en weg te houden van licht gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Centrifuge cel plaat gedurende 10 minuten bij 168 x g.
- Verwijder supernatant en voeg 100 ul DMSO per putje.
LET OP: Wees voorzichtig. Raak de naaldvormige kleurstof kristallen. - Schud de plaat gedurende 10 minuten bij lage snelheid om de kristallen volledig te ontbinden.
- Meet absorptie bij 570 nm doormet behulp van een microplaat spectrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens het transformatieproces worden de morfologische veranderingen van de cellen gevisualiseerd door lichtmicroscopie (figuur 2). Kleine clusters van cellen waren duidelijk zichtbaar met de dichtheidsgradiënt scheidingsmethode 7 dagen na infectie, terwijl slechts een dikke laag celfragmenten zijn zichtbaar vanaf de rode bloedcellen lysismethode. Echter, lymfoblastoïde cel clusters zijn zichtbaar onder de dikke laag celfragmenten 30 dagen na infectie. Met frequentere mediumverversing, celafval af en celclusters duidelijk zichtbaar en brengt het door de dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze dezelfde afbeelding.
Wanneer cellijnen met succes werden vastgesteld, werd de MTT-assay toegepast om de levensvatbaarheid van B-LCL evalueren. Volgens de literatuur 17, die door verschillende werkwijzen B-LCL's werden geselecteerd om de levensvatbaarheid van de cellen en 16 detecteren40 medium werd als blanco controle. De gegevens geven aan dat de levensvatbaarheid van de cellen van B-LCL gelegd met de rode bloedcellen lysiswerkwijze aanzienlijk hoger dan de cellevensvatbaarheid van B-LCL door de dichtheidsgradiënt scheidingsmethode (figuur 3).
Figuur 1. Stroomschema van orde. Antistollingsmiddel bloed behandeld met rode bloedcellen lysisbuffer vóór EBV infectie gevolgd door de toevoeging van CsA. De geïnfecteerde B-cellen worden gekweekt bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2 te stellen en vervolgens uitbreiden B-LCL. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Visualisatie van cellulaire morfologische veranderingen in het proces van EBV Transformation. De links zijn B-LCL opgericht door de rode bloedcel lysis methode met 0,5 ml perifeer bloed, en celresten afneemt naarmate de tijd vordert. De rechter geeft door de dichtheidsgradiënt methode scheiding met 2,5 ml bloedmonster cellijnen. Schaal bar is 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Vergelijking van de levensvatbaarheid van de cellen voor het B-LCL Opgericht door verschillende methoden. Elke staaf stelt het gemiddelde ± SD. De resultaten tonen dat er significant verschil tussen de twee methoden (p = 0,014). Klik hier alsjeblieftvoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij rapporteren de ontwikkeling van een nieuwe werkwijze voor het onsterfelijk maken van humane B cellen uit bloed door lyseren van rode bloedcellen en de cellevensvatbaarheid van gevestigde B-LCL werd geëvalueerd door de MTT-bepaling. De resultaten toonden aan dat de cellevensvatbaarheid van de bij de rode bloedcel lysis methode B-LCL veel hoger dan die van de dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze. Het grote voordeel van de rode bloedcellen lysis methode is dat het eenvoudig en vereist een klein volume (slechts 0,5 ml) bloed voor een permanente cellijn met een hoog rendement en hoge cellevensvatbaarheid.
Slechts één eenvoudige stap lysis nodig voor EBV infectie. Zonder voorafgaande zuivering van de lymfocyten, celverlies en cellulaire beschadiging vermeden. Een ander obstakel van de dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze hemolyse. Het verwerken van het bloed na langdurige opslag bij ongepaste temperaturen en schudden tijdens het transport kan leiden tot hemolyse, which will grote invloed op de isolatie van lymfocyten. Andere studies toonden aan dat het gebruik van rode bloedcellen (RBC) lysis resulteerde in hogere aantallen levensvatbare PBMC dan gebruik van de scheidingswerkwijze dichtheidsgradiënt 18 en lymfocyt subtypes niet substantieel, 19 beïnvloed. Vergeleken met de dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze, die kostbaar en omslachtig, de rode bloedcel lysis methode veel eenvoudiger, met name voor het behandelen van een groot aantal klinische monsters en praktischer voor beginners.
In de studie hebben wij 24 monsters met een 100% slagingspercentage onsterfelijk gemaakt door de rode bloedcel lysis methode. In vergelijking met de 90-94% van de kans op succes door gecryopreserveerd lymfocyten gemeld en vers geïsoleerde lymfocyten 20 2 - 2,5 ml bloed, dit slagingspercentage is veel hoger. Ondertussen hebben we ook getransformeerd vers (0,5 ml) of bevroren (zelfs 1 ml) bloed, zoals beschreven in de referenties 14-15 zonder afscheiding en de efficiency transformatie is veel lager dan de gerapporteerde 16 (gegevens niet getoond).
De huidige strategie verbetert niet alleen immortalisatie efficiëntie aanzienlijk, maar vermindert ook de hoeveelheid bloed vereist om B-LCL stellen. De huidige technologieën voor EBV transformatie gebruiken relatief grote hoeveelheden van het perifere bloed, ongeveer 2-2,5 ml bloed 20 tot lymfocyten te isoleren, terwijl anderen vereisen 10 ml of meer 10,21. Dit in tegenstelling tot de 0,5 ml volbloed nodig een geïmmortaliseerde cellijn met de hier beschreven werkwijze te verkrijgen. Deze methode kan worden aangepast om bloed vanuit vinger succes onsterfelijk prikt 12, die sterk zou vergemakkelijken instandhouding van de genetische bronnen van pediatrische patiënten en ouderen.
Bovendien, de cellevensvatbaarheid van door de rode bloedcel lysis methode B-LCL hoger dan die van de dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze. De rode bloedcel llyse methode vermijdt de mechanische centrifugaalkracht bezig dichtheidsgradiënt centrifugatie, die onherstelbare schade aan de cellen veroorzaakt. Het suggereert dat de lysis van rode bloedcellen methode is geschikt voor genetische en functionele studies, die veel vergt cellen zo snel mogelijk. Onze methode zal de tijd van cultuur initiatie tot cryopreservatie, welke middelen zal besparen en arbeid te verminderen verminderen.
Een mogelijke beperking van de rode bloedcel lysis methode is de aanwezigheid van verontreinigende resten afgeleid van rode bloedcellen lysaten die duidelijk waarneming van transformatie in de eerste vier weken van EBV-infectie zouden blokkeren. Dit zal echter vuil geleidelijk worden verwijderd met mediumveranderingen. Een andere beperking is het verlies van groeiende getransformeerde cellen, maar dit kan worden verbeterd door het verwijderen van de helft van de supernatant in de eerste vier weken van transformatie. Een andere mogelijke modificatie verwijderen van verontreinigingen morefrequente veranderingen van medium met grotere volumes of wassen cellijnen tweemaal met 10 ml 1x PBS en vervolgens centrifugeren bij 168 xg gedurende 5 minuten om verontreinigingen te verwijderen.
Kortom, dit protocol voorziet in een eenvoudige strategie voor de oprichting van B-LCL met een hoge immortalisatie efficiency, het verminderen van het bloedvolume en het opslaan van de tijd tussen de initiatie en cryopreservatie. De cellijnen ontwikkeld in deze studie een waardevolle en rendabele bron van biomaterialen voeren verschillende studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
