Summary
Un semplice metodo di lisi dei globuli rossi per stabilire B-LCL stato sviluppato con alta efficienza di immortalizzazione, richiede una piccola quantità di sangue e risparmio di tempo tra l'inizio di crioconservazione.
Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Genetica e Biologia dello sviluppo, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per il benessere umano.
1. Preparazione di EB Virus
- Il giorno 1, scongelare B95-8 cellule e di coltura in 6 mL completo RPMI 1640 medium, supplementato con 10% siero fetale bovino, 2 mM L-glutammina e antibiotici (100 mg / ml di streptomicina, 100 U / ml penicillina) in un T25 pallone di coltura. Mettere il pallone di coltura in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C.
- Il giorno 2, osservare la morfologia delle cellule al microscopio. Le cellule sono in buone condizioni quando sono luminose e rotondo. Aggiungere 10 ml completo di media RPMI 1640.
- Il giorno 4, aggiungere 10 ml di fresco completo RPMI 1640, e poi trasferire in un pallone di coltura T75.
- Il giorno 8, aggiungere 20 ml completo di media RPMI 1640.
- Mantenere le cellule per 8 giorni senza l'aggiunta di mezzo fresco, vale a dire, la fame.
- Il giorno 16, osservare le celluleosservata al microscopio. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 centrifuga, 12 ml / provetta.
- Cryo-conservazione a -80 ° C per 1 ora, e poi rapidamente scongelare a 37 ° C. Ripetere 3 volte fino a quando le particelle virali vengono rilasciati dalle cellule.
- Centrifugare a 240 xg per 10 min a temperatura ambiente.
- Filtrare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron, aliquota, 12 mL / tubo, e conservare a -80 ° C.
2. Trattamento di sangue intero con Globulo rosso Lysis Buffer
- Aggiungere 0,5 ml di sangue intero anticoagulato con EDTA · K 2 in una provetta da 15 ml.
- Mettere 1 ml tampone di lisi dei globuli rossi (filtrati da 0,22 micron filtro e scongelati a temperatura ambiente prima dell'uso) per il sangue intero e mescolare bene. Posizionare la miscela a temperatura ambiente per 4 min. Poi aggiungere 5 - 7 mL PBS 1x rapidamente alla reazione di arresto.
- Centrifugare a 240 xg per 5 min a temperatura ambiente. I globuli bianchi precipitano sul fondo della provetta.
- Eliminare il surnatante e lavare la precipitazione con l'aggiunta di 7 ml 1640 medium di base. Centrifugare per 5 minuti a 240 xg a temperatura ambiente. Ripetere due volte.
- Risospendere il pellet di cellule in 300 microlitri di media trasformazione (terreno RPMI 1640, contenente 20% di siero fetale bovino e 10 ug / ml fitoemoagglutinina (PHA)).
3. EBV infezione
- Aggiungere 60 ml di 20 mg / ml ciclosporina A (CsA) alla sospensione cellulare.
- Rapidamente scongelare un'aliquota di EBV a 37 ° C. Aggiungere 240 microlitri EBV alla sospensione cellulare.
- Mescolare bene e mettere la sospensione cellulare ad una piastra a 96 pozzetti, 200 ml per pozzetto. Per evitare l'evaporazione, aggiungere 200 microlitri di PBS 1x ad ogni bene intorno della piastra a 96 pozzetti. Porre la piastra in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C.
4. Ampliamento e crioconservazione di B-LCL
- Modificare la metà del mezzo una volta a settimana per il primo mese dopo l'infezione da EBV. Solo un laye spessorer di frammenti cellulari è visibile al microscopio al giorno 7 (figura 2). Dopo un mese di infezione EBV, gruppi di cellule linfoblastoidi sono visibili sotto uno spesso strato di frammenti cellulari al microscopio (Figura 2).
- Cambiare la metà del mezzo ogni 3 giorni fino a quando i gruppi di cellule sono chiaramente visibili al microscopio (Figura 2). In genere, questo processo richiede da 10 a 20 giorni.
- Dopo la miscelazione, pipettare le cellule e trasferire alla piastra 24 pozzetti. Raddoppiare il volume di terreno di coltura con completo RPMI 1640 mentre diventa giallo. Questo processo dipende dal tasso di crescita cellulare.
- Successivamente, trasferire le cellule a pallone di coltura T25. Raddoppiare il volume del terreno di coltura come risulta giallo finché il volume del mezzo espande a 10 - 15 mL.
- Cambiare media 24 ore prima del congelamento. sospensione cellulare Centrifugare per 5 min a 240 x g. Contare le cellule con un contatore di cellule e congelare ad una densità di 5 - 10 x 10 6 / ml in frSoluzione Ozen contenente 90% FBS e il 10% dimetilsolfossido (DMSO). Congelare a una velocità di 1 ° C per min a -80 ° C e poi trasferire direttamente in azoto liquido.
5. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT) Assay 17
- Preparare una sospensione singola cellula B-LCL con il mezzo 1640 contenente il 10% di siero fetale bovino. Seed 3 x 10 4 cellule per pozzetto sulla piastra da 96 pozzetti, 100 ml per pozzetto.
- Porre la piastra in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per 12 - 16 h.
- Aggiungere MTT (5 mg / ml) per i pozzi in cui le cellule sono in crescita e tenere lontano dalla luce per 4 ore a 37 ° C.
- piastra di cella Centrifugare per 10 min a 168 x g.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 ml di DMSO per pozzetto.
NOTA: Attenzione. Non toccare i cristalli di colorante aghiformi. - Agitare la piastra per 10 min a bassa velocità per sciogliere completamente i cristalli.
- l'assorbimento di misura a 570 nm perutilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.
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Representative Results
Durante il processo di trasformazione, i cambiamenti morfologici di cellule sono visualizzati al microscopio ottico (Figura 2). Piccoli gruppi di cellule erano chiaramente visibile con il metodo di separazione gradiente di densità dopo 7 giorni di infezione, mentre solo uno spesso strato di frammenti cellulari sono visibili dal metodo di lisi dei globuli rossi. Tuttavia, gruppi di cellule linfoblastoidi sono visibili sotto lo spesso strato di frammenti di cellule di 30 giorni dall'infezione. Con più frequente cambiamento medio, diminuisce detriti cellulari ei cluster cellulari sono chiaramente visibili e presentano la stessa immagine stabilita dal metodo di densità di separazione gradiente.
Quando le linee cellulari sono state stabilite con successo, il saggio MTT è stato utilizzato per valutare la fattibilità di B-LCL. Secondo la letteratura 17, B-LCL stabilita con metodi differenti sono stati selezionati per rilevare la vitalità cellulare e 1640 supporto è stato utilizzato come controllo in bianco. I dati indicano che la vitalità cellulare di B-LCL stabilito con il metodo di lisi dei globuli rossi è significativamente superiore alla vitalità cellulare dei B-LCL dal metodo di separazione gradiente di densità (Figura 3).
Figura 1. Diagramma di flusso di procedura. sangue anticoagulante viene trattato con tampone di lisi dei globuli rossi prima dell'infezione EBV seguita dall'aggiunta di CsA. Le cellule B infettate sono coltivate a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2 per stabilire e successivamente espandere B-LCL. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Fifigura 2. La visualizzazione dei cellulari morfologiche cambiamenti nel processo di trasformazione EBV. La sinistra è B-LCL stabilito con il metodo di lisi dei globuli rossi con 0,5 ml di sangue periferico, e detriti cellulari diminuendo col passare del tempo. La destra mostra linee cellulari stabilizzate dal metodo di separazione gradiente di densità con 2,5 mL di campione di sangue. barra della scala è di 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Confronto di vitalità cellulare per B-LCL Fondata con diversi metodi. Ogni barra rappresenta media ± SD. I risultati mostrano che vi era una differenza significativa tra i due metodi (p = 0,014). Per favore clicca quiper visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Riportiamo lo sviluppo di un nuovo metodo per immortalare cellule B umane da sangue intero mediante lisi dei globuli rossi, e la sua vitalità cellulare dei stabilita B-LCL è stata valutata mediante il saggio MTT. I risultati hanno mostrato che la vitalità cellulare di B-LCL stabilita con il metodo di lisi dei globuli rossi è molto superiore a quella del metodo di separazione gradiente di densità. Il principale vantaggio del metodo di lisi dei globuli rossi è che è semplice e richiede un piccolo volume (non più di 0,5 ml) di sangue per stabilire una linea cellulare permanente con un alto tasso di successo e alta vitalità cellulare.
Solo è necessario un semplice passo lisi prima infezione da EBV. Senza precedente purificazione dei linfociti, la perdita di cellule e danni cellulari sono evitati. Un altro ostacolo del metodo di separazione di densità gradiente è emolisi. Elaborazione del sangue dopo la conservazione a lungo termine a temperature inadeguate e scuotendo durante il trasporto può causare emolisi, which influenzerà notevolmente l'isolamento dei linfociti. Altri studi hanno dimostrato che l'uso di globuli rossi (RBC) lisi portato a un numero maggiore di vitale PBMC che l'uso del metodo di separazione gradiente di densità 18 e linfociti sottotipi non sono stati influenzati sostanzialmente 19. Rispetto al metodo di separazione gradiente di densità, che è costosa e ingombrante, il metodo di lisi dei globuli rossi è molto più facile, soprattutto per il trattamento di un gran numero di campioni clinici e più pratico per principianti.
Nello studio, abbiamo immortalato 24 campioni con un tasso di successo del 100% utilizzando il metodo di lisi dei globuli rossi. Rispetto al 90-94% del tasso di successo riportato da linfociti crioconservati e linfociti appena isolate 20 con 2-2,5 ml di sangue, questo tasso di successo è molto più alto. Nel frattempo, abbiamo anche trasformato fresco (0,5 ml) o congelati di sangue (anche 1 ml), come descritto nei riferimenti 14,15 senza separazione, e l'efficienzecy di trasformazione è molto più basso di quello riportato 16 (dati non mostrati).
L'attuale strategia non solo migliora l'efficienza immortalizzazione in modo significativo, ma riduce anche il volume di sangue necessario per stabilire B-LCL. Tecnologie attuali per EBV trasformazione uso relativamente grandi volumi di sangue periferico, a circa 2 - 2,5 ml di sangue da 20 a isolare i linfociti, mentre altri richiedono 10 ml o più 10,21. Ciò contrasta con 0,5 ml di sangue intero necessarie per ottenere una linea cellulare immortale con il metodo qui descritto. Questo metodo potrebbe essere modificato per immortalare con successo raccolto dal dito del sangue punge 12, che potrebbe notevolmente facilitare preservare le risorse genetiche di pazienti pediatrici e anziani.
Inoltre, la vitalità cellulare di B-LCL stabilita con il metodo di lisi dei globuli rossi sono superiore a quella del metodo di separazione gradiente di densità. La cella l sangue rossoYsis metodo evita la forza meccanica centrifuga nel processo di centrifugazione in gradiente di densità, che provoca danni non riparabili alle cellule. Si suggerisce che il metodo di lisi dei globuli rossi è più adatto per studi genetici e funzionali, che richiede un gran numero di cellule più rapidamente possibile. Il nostro metodo si riduce il tempo dalla cultura iniziazione alla crioconservazione, che farà risparmiare risorse e ridurre il lavoro.
Una possibile limitazione del metodo di lisi dei globuli rossi è la presenza di contaminanti residui derivati da lisati globuli rossi, che potrebbe bloccare la chiara osservazione di trasformazione nelle prime quattro settimane di infezione EBV. Tuttavia, questi detriti sarà progressivamente rimosso con il mezzo modifiche. Un'altra limitazione è la perdita delle crescenti cellule trasformate, ma questo può essere migliorata rimuovendo la metà del surnatante nelle prime quattro settimane di trasformazione. Un'altra possibile modifica per eliminare le impurezze piùfrequenti cambiamenti medi con maggiori volumi o lavaggio delle linee cellulari due volte con 10 ml di PBS 1x e centrifugazione a 168 xg per 5 minuti per rimuovere le impurità.
In sintesi, questo protocollo prevede una semplice strategia per la creazione di B-LCL ad alta efficienza immortalizzazione, riducendo il volume del sangue e di tempo che intercorre tra l'inizio e la crioconservazione di risparmio. Le linee cellulari sviluppate nel presente studio forniscono una fonte preziosa e conveniente di biomateriali effettuare vari studi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
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