Summary
B-LCLs'in kurulması için basit bir kırmızı kan hücre parçalama yöntemi kan küçük bir miktar gerektiren ve dondurarak saklama için başlangıcından itibaren zaman tasarrufu, yüksek ölümsüzleşme verimliliği ile geliştirilmiştir.
Protocol
Bu çalışma Genetik ve Gelişimsel Biyoloji Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylandı ve protokol insan refahı için kurumsal kuralları takip eder.
EB Virüs hazırlanması 1.
- 1. günde, 6 mL B95-8 hücreler ve kültür çözülme tam RPMI 1640 ortamı, bir% 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin ve antibiyotikler (100 ug / ml streptomisin, 100 U / ml penisilin) ile desteklenmiş T25 kültürü şişesi. 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübatörde kültür şişesi yerleştirin.
- 2 gün, mikroskop altında hücre morfolojisi gözlemlemek. Onlar parlak ve yuvarlak olduğunda Hücreler iyi durumda. 10 ml tam RPMI 1640 ortamı ekleyin.
- 4. günde, 10 ml taze tam RPMI 1640 ortamı ekleyin ve sonra T75 kültür şişesine aktarın.
- 8. günde, 20 ml tam RPMI 1640 ortamı ilave edin.
- Yani taze orta, açlık eklemeden 8 gün boyunca hücreleri korumak.
- günde 16, hücreleri gözlemlemekmikroskop altında gözlenmiştir. 15 ml bir santrifüj tüpüne, 12 ml / tüp hücreleri toplamak.
- 1 saat boyunca -80 ° C'de dondurularak korumak ve daha sonra hızlı bir şekilde 37 ° C'de eritin. Virüs partikülleri hücrelerin serbest kadar 3 kez tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 240 x g'de santrifüjleyin.
- -80 ° C de 0.22 mikron filtre, kısım, 12 ml / tüp ve mağaza süpernatanın filtre.
Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tampon ile Tüm Kanı 2. Tedavi
- 15 ml tüp EDTA · K 2 tarafından Antikoagüle 0.5 mL tam kan ekleyin.
- Bütün kan (kullanmadan önce 0,22 um filtre ile filtre edildi ve oda sıcaklığına kadar çözündürüldü) 1 ml kırmızı kan hücre parçalama tamponu kondu ve iyice karıştırın. 4 dakika boyunca oda sıcaklığında karışım yerleştirin. durdurma reaksiyonu hızlı 7 mL 1x PBS - O 5 ekleyin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 240 x g'de santrifüjleyin. Beyaz kan hücrelerinin, tüpün alt çökelecektir.
- supernatant atmak ve 7 ml 1640 temel orta ekleyerek yağış yıkayın. Oda sıcaklığında 240 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj. İki kez tekrarlayın.
- (% 20 fetal bovin serumu ve 10 ug / ml fitohemaglutinin (PHA) ihtiva eden, RPMI 1640 ortamı) 300 uL dönüşüm ortamı içinde hücre pelletini.
3. EBV enfeksiyonu
- Hücre süspansiyonu 20 ug / mL, siklosporin A, 60 ul (CSA) ekleyin.
- Hızla 37 ° C'de EBV bir kısım Çözülme. hücre süspansiyonu 240 mcL EBV ekleyin.
- İyice karıştırın ve oyuk başına, 96 çukurlu bir levhaya 200 uL hücre süspansiyonu yerleştirin. , Buharlaşmayı önlemek 96 oyuklu plakanın çevresindeki her bir oyuğa 200 uL 1x PBS ekleyin. 37 ° C'de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde plaka koyun.
B-LCLs'in 4. Genişleme ve Kryoprezervasyon
- EBV enfeksiyonu sonrası ilk ay haftada bir kez orta yarısı değiştirin. Sadece kalın layeHücre fragmanları R 7. günde (Şekil 2) mikroskop altında görülebilir. EBV enfeksiyonu Bir ay sonra, lenfoblastoid hücre kümeleri mikroskobu (Şekil 2) altında hücre parçalarının kalın bir tabaka altında görebilir.
- Hücre kümeleri açıkça mikroskop (Şekil 2) altında görünür olana kadar her 3 günde bir orta yarısı değiştirin. Tipik haliyle, bu işlem, 10 ila 20 gün sürer.
- Karıştırma işleminden sonra, hücreler pipetleme ve 24 yuvalı plakaya aktarılır. sarı döner iken tam RPMI 1640 ile kültür ortamı hacmi ikiye katlayın. Bu işlem, hücre büyümesinin hızına bağlıdır.
- Daha sonra, T25 kültür şişelerinde hücreleri transferi. 15 ml - orta hacmi 10 genişler kadar sarıya döner olarak kültür ortamı hacmi ikiye katlayın.
- dondurmadan önce orta 24 saat değiştirin. 240 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje hücre süspansiyonu. FR 10 x 10 6 / mL - 5 bir yoğunlukta bir hücre sayacı ve dondurularak ile hücre sayımı% 90 FBS ve% 10 dimetilsülfoksit (DMSO) ihtiva eden Özen stok çözeltisi. -80 ° C'ye kadar ve dakika başına 1 ° C bir hızda dondurma ve daha sonra doğrudan sıvı azot içine aktarın.
5. 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolyum bromürde (MTT) deneyi 17
- % 10 fetal sığır serumu ihtiva eden 1640 ortamı ile bir B-LCLs'in tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. De üzerinde 96 oyuklu plaka başına tohum 3 x 10 4 hücre, oyuk başına 100 uL.
- 16 saat - 12 ve 37 ° C 'de CO2 inkübatör% 5 plaka koyun.
- Hücreler büyüdükten edildiği çukurlara MTT (5 mg / ml) ilave edilir ve 37 ° C'de 4 saat boyunca ışıktan uzak tutulur.
- 168 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj hücre plakası.
- Süpernatantı ve oyuk başına 100 uL DMSO ilave edin.
NOT: Dikkatli olun. iğne şeklindeki boya kristalleri dokunmayın. - kristalleri tamamen çözünmesi için düşük hızda 10 dakika için plakayı sallayın.
- 570 nm ölçün emmeBir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dönüşüm işlemi sırasında hücrelerin morfolojik değişimler ışık mikroskobu (Şekil 2) tarafından görüntülenmiştir. Hücre parçaları yalnızca kalın tabaka alyuvar lisiz yöntemi görebilir ise küçük hücre kümeleri, 7 günlük enfeksiyon sonrası yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile açık bir şekilde görülebildi. Bununla birlikte, lenfoblastoid hücre kümeleri 30 gün enfeksiyondan hücre parçalarının kalın bir tabaka altında görebilir. daha sık orta değişiklikle, hücre enkaz azalır ve hücre kümeleri açıkça görülebilir ve yoğunluk gradyan ayırma yöntemiyle kurulan aynı görüntüyü sunmak.
hücre çizgileri başarıyla kurulduğunda, MTT deneyi B LCLlerin uygulanabilirliğini değerlendirmek için kullanıldı. Literatürde 17'ye göre farklı yöntemler ile kurulan B-LCLs hücre canlılığı ve 16 tespit etmek için seçildi40 ortamı boş bir kontrol olarak kullanılmıştır. Veri alyuvar lisiz yöntemi ile kurulan B-LCLlerin hücre canlılığı yoğunluk gradyan ayırma yöntemi (Şekil 3) B-LCLlerin hücre canlılığı önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermektedir.
Prosedür Şekil 1. Akış Şeması. Antikoagülan kan CsA ilave edildi EBV enfeksiyonundan önce alyuvar lisiz tamponu ile işlenir. Enfekte B hücreleri B-LCLlerin oluşturulması ve daha sonra genişletmek için,% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de yetiştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FiEBV Dönüşüm Sürecinde Hücresel Morfolojik Değişimlerin şekil 2. Görselleştirme. Sol B-LCLs 0.5 mL periferik kan kırmızı kan hücre parçalama yöntemi ile kurulan ve zaman olarak azalan hücre enkaz devam edilir. Sağ 2.5 ml kan örneği ile yoğunluk gradyan ayırma yöntemiyle oluşturulan hücre çizgileri göstermektedir. Ölçek çubuğu 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Farklı Yöntemlerle kurulan B-LCLs'in Hücre canlılığı 3. karşılaştırılması. Her çubuk ortalama ± SD temsil eder. Sonuçlar iki yöntem (p = 0.014) arasında anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir. Lütfen buraya tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu, kırmızı kan hücrelerinin lize kandan insan B hücrelerini ölümsüz için yeni bir yöntemle geliştirilmesi rapor etmekte ve B-LCLs'in MTT testi ile değerlendirildi oluşturulan kendi hücredeki mevcudiyetini göstermektedir. Sonuçlar alyuvar lisiz yöntemi ile kurulan B-LCLlerin hücre canlılığı yoğunluk gradyan ayırma yöntemi çok daha yüksek olduğunu göstermiştir. Kırmızı kan hücresi parçalama yöntemin başlıca avantajı, basit ve yüksek başarı oranına ve hücre yaşayabilirliği ile kalıcı bir hücre hattı kurmak için kan (0.5 mL kadar az) küçük bir hacmini gerektirir.
Sadece basit bir parçalama adımı EBV enfeksiyonu önce ihtiyaç vardır. lenfositlerin mi saflaştırılmadan hücre kaybı ve hücresel hasarlar önlenmektedir. yoğunluk gradyan ayırma yönteminin başka bir engel hemoliz olduğunu. WH olmayan sıcaklıklarda uzun süreli depolama sonrası, kan işleme ve taşıma sırasında çalkalama hemolize neden olabilirIch ölçüde lenfositlerinin izolasyonu etkileyecektir. Diğer çalışmalar, kırmızı kan hücresi (RBC) lizis kullanımı 18 ve lenfosit alt tipleri esas olarak 19 etkilenmemiştir yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanılarak daha uygulanabilir PBMC daha fazla sayıda yol açtığını gösterdi. maliyetli ve hantal yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile karşılaştırıldığında, alyuvar lisiz yöntemi, özellikle büyük bir klinik örneklerin sayısı ve acemiler için daha pratik tedavi edilmesi için, çok daha kolaydır.
Çalışmada, kırmızı kan hücre parçalama yöntemini kullanarak% 100 başarı oranı ile 24 numune ölümsüzleştirdi var. Başarı dondurulan lenfositler tarafından bildirilen oran ve taze izole lenfositlerin 90-94 oran% 2 ile 20-2,5 ml kan, bu başarı oranı çok daha yüksektir. Bu arada, aynı zamanda, taze (0.5 mL) dönüştürülmüş ya da ayrılmadan, bir referans 14,15 tarif edildiği gibi (hatta 1 mL) kan dondurulmuş ve Verimdönüşüm CY rapor 16 (veriler gösterilmemiştir) daha düşüktür.
Mevcut strateji önemli ölçüde ölümsüzleşme verimliliğini artırır, aynı zamanda B-LCLs'in kurmak için gerekli kan hacmini azaltır. Diğer 10 mL 10,21 ya da daha fazla gerektirmektedir 2.5 ml kan 20 lenfositleri izole göre - EBV transformasyonu için mevcut teknolojiler, yaklaşık 2, periferal kan, nispeten büyük miktarlarda kullanımı. Burada tanımlanan yöntemi ile bir ölümsüzleştirilmiş hücre çizgisi elde etmek için gerekli olan tam kan, 0.5 mL tezat teşkil etmektedir. Bu yöntem başarıyla parmağın toplanan kan ölümsüzleştirmek için modifiye edilebilir ölçüde pediatrik hastalar ve yaşlılar genetik kaynaklarını korumaya kolaylaştırabilir 12, azabı.
Buna ek olarak, kırmızı kan hücresi parçalama yöntemi ile kurulan B-LCLlerin hücre canlılığı yoğunluk gradyan ayırma yöntemi daha yüksektir. Eritrosit lölçmeye yöntemi hücrelere tamir edilemez hasara neden yoğunluk gradyanlı santrifüj işleminde mekanik santrifüj kuvveti önler. Bu, kırmızı kan hücresi parçalama yöntemi mümkün olan en kısa sürede büyük hücre numaraları gerektiren genetik ve fonksiyonel çalışmalar için daha uygun olduğunu göstermektedir. Bizim yöntem kaynak tasarrufu ve emek azaltacaktır dondurulması kültür başlangıcından, saati azalacak.
Kırmızı kan hücresi parçalama yöntemi muhtemel bir sınırlama EBV enfeksiyonundan ilk dört hafta içinde dönüşüm açık bir inceleme engelleyecek kırmızı kan hücre lizatları elde artıkları kirletici varlığıdır. Ancak, bu enkaz yavaş yavaş orta değişikliklerle silinecektir. Diğer bir sınırlama, artan dönüştürülmüş hücrelerin kaybı, fakat bu dönüşümün ilk dört hafta içinde süpernatanın yarısı kaldırarak iyileştirilebilir. kirleri çıkarmak için başka bir muhtemel değişikliğe dahadaha hacimli ya da 10 ml 1 x PBS ile iki kez hücre çizgileri yıkanması ve daha sonra yabancı maddeleri uzaklaştırmak için 5 dakika boyunca 168 x g'de santrifüj ile sık sık, orta değişir.
Özetle, bu protokol, yüksek ölümsüzleşme verimliliği ile B-LCLs'in kuran kan hacmini azaltarak ve başlatılması ve dondurarak saklama arasındaki zaman tasarrufu için basit bir strateji sağlar. Bu çalışmada kullanılan hücre çizgileri biyo değerli ve maliyet-etkin bir kaynak, çeşitli çalışmalar yapmak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
