Introduction
La crescente importanza della risonanza magnetica (MRI) nella diagnosi clinica, che è limitata dalla sensibilità intrinseca della tecnica, ha portato alla rapida crescita della ricerca per lo sviluppo di nuovi agenti di contrasto a base di gadolinio (GBCAs) 1. GBCAs sono molecole che vengono somministrati per migliorare la qualità dell'immagine, e che in genere hanno la struttura chimica di uno ione trivalente gadolinio (Gd 3+) coordinato ad un ligando polidentato. Questa complessazione è di importanza critica come unchelated Gd 3+ è tossico; essa è stata implicata nello sviluppo di fibrosi sistemica nefrogenica in alcuni pazienti con malattia renale o insufficienza 2. Di conseguenza, rilevando lo ione libero acquosa è fondamentale per garantire la sicurezza dei GBCAs. La presenza di unchelated Gd 3+ nelle soluzioni GBCA spesso è il risultato di una reazione incompleta tra il ligando e lo ione, la dissociazione del complesso, o displacement da altri cationi metallici biologiche 3.
Tra le varie tecniche attualmente utilizzate per la determinazione della presenza di Gd 3+, quelli che usano cromatografia e / o spettrometria grado più alto in termini di versatilità e applicabilità 4. Tra i loro punti di forza sono l'alta sensibilità e precisione, la capacità di analizzare diverse matrici di campioni (compresi siero umano 5, urine e capelli 6, acque di scarico 7 e contrasto agente formulazioni 8), e la quantificazione simultanea di più 3+ complessi di Gd (una scheda di studi prima al 2013 è descritto in una revisione completa da Telgmann et al.) 4. L'unico inconveniente è che molti di questi metodi richiedono strumentazioni (come la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente) 4 che alcuni laboratori non possono avere accesso. Nel contesto della nuova scoperta GBCA alla ricerca e livelli proof-of-concept, arMetodo elatively più conveniente, rapida e conveniente spettroscopica basata (come l'assorbimento UV-Vis o fluorescenza) può servire come una valida alternativa. Con queste applicazioni in mente, un sensore di aptameri a base acquosa fluorescente per Gd 3+ è stato sviluppato 9.
Il aptameri (Gd-aptamero) è una lunga molecola di DNA a singolo filamento 44-base con una specifica sequenza di basi che è stata isolata attraverso il processo di evoluzione sistematica dei ligandi di arricchimento esponenziale (SELEX) 9. Per adattare l'aptamero in un sensore fluorescente, un fluoroforo è attaccato al terminale 5 'del filamento, che viene quindi ibridato con un filamento di tempra (QS) con 13 basi complementari (Figura 1). Il QS è etichettato con una molecola quencher scuro al 'capolinea 3. In assenza di Gd 3+, il sensore (Gd-sensore), costituito da un rapporto 1: 2 moli di Gd-aptamero e QS rispettivamente avrà emissione di fluorescenza minima dovuta ttrasferimento di energia o dal fluoroforo alla quencher. L'aggiunta di soluzione acquosa di Gd 3+ sposterà QS dal Gd-aptamer, con un conseguente aumento di emissione di fluorescenza.
Figura 1. Il sensore (Gd-sensore) che consiste nella aptamer 44-passo lungo (Gd-aptamero) codificata con fluoresceina (un fluoroforo) e il 13-passo lungo tempra filamento (QS) contrassegnati con DABCYL (un quencher scuro) . In assenza di unchelated Gd 3+, la fluorescenza del sensore è minima. Con l'aggiunta di Gd 3+, spostamento del QS si verifica e si osserva un aumento di emissione di fluorescenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Vi è attualmente, quello comunemente usato metodo spettroscopico-based per rilevareing acquosa 3+ Gd. Questo saggio utilizza arancione xilenolo molecola, che subisce uno spostamento della lunghezza d'onda massima assorbimento dai 433 ai 573 nm su di chelazione allo ione 10. Il rapporto tra queste due assorbanza massimi può essere utilizzato per quantificare la quantità di unchelated Gd 3+. Il sensore aptamero è un'alternativa (può anche essere complementari) al dosaggio xilenolo arancio, come i due metodi hanno le condizioni di reazione (come il pH e la composizione delle soluzioni tampone utilizzato), selettività bersaglio, gamme lineari di quantificazione, e le modalità di rilevamento 9.
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Protocol
NOTA: l'acqua di biologia molecolare di grado è utilizzato in tutte le preparazioni tampone ed una soluzione. Tutti i tubi monouso (microcentrifuga e PCR) e puntali sono DNase- e RNase-free. Si prega di consultare la scheda di sicurezza (SDS) per tutte le sostanze chimiche prima dell'uso. L'utilizzo di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) è fortemente raccomandato.
1. Preparazione dei aptamero archivio Solutions
- Acquisto 2 basi di polydeoxynucleotide commercio. Ordinare entrambi i filamenti con purificazione tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
Parte 1 (Gd-aptamero):
5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
Parte 2 (QS):
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - Sciogliere ogni filo in acqua per fare 100 micron singole soluzioni di riserva del Gd-aptamer e il QS.
- Conservare queste soluzioni a -20 ° C. Le soluzioni sono stabili finora, per 3 anni.
- Per ridurre al minimo freezcicli e-disgelo, memorizzare le soluzioni madre in 10 microlitri aliquote.
2. Preparazione del 2x Gd-sensore Solution
- Preparare il tampone (20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Regolare il pH a ~ 7,4 con NaOH e HCl, e filtrare bottiglia migliori filtri sterili monouso con 0,2 micron membrana PES. Conservare in bottiglie sterili. Se filtrato e conservato correttamente (a temperatura ambiente), il buffer è stabile finora, per 2 anni.
- Diluire 1 ml di soluzione di Gd-aptamer magazzino (dal punto 1.2) e 2 ml di soluzione di riserva QS (dal punto 1.2) in 497 ml di tampone. Mescolare bene con un vortice. La loro concentrazione nella soluzione Gd-sensore 2x sono 200 e 400 nm, rispettivamente.
NOTA: Il volume della soluzione Gd-sensore 2x preparato in questa fase è 500 ml, che è sufficiente per testare 6 - 7 concentrazioni variabili di Gd 3+ per la curva di calibrazione e le soluzioni di contrasto(Fase 3). Ogni campione darà pozzetti duplicati in una piastra da 384 pozzetti.- Regolare il volume della soluzione di Gd-sensore 2x in base al numero di soluzioni Gd 3+ che deve essere testato.
- Trasferire la soluzione Gd-sensore 2x in 9 provette PCR, con 50 microlitri in ogni provetta. Mettere le provette in un termociclatore.
- Impostare il programma nel termociclatore per riscaldare la soluzione nei tubi a 95 ° C, tenere premuto per 5 min e quindi raffreddare lentamente la soluzione a 25 ° C sopra ~ 15 min (al tasso di ~ 0.05 - 0,1 ° C / S). Il ciclo di riscaldamento e raffreddamento è di garantire ibridazione ottimale tra il Gd-aptamer e QS. risultati parziali ibridazione in tempra incompleta e uno sfondo più elevata fluorescenza del sensore. Se un termociclatore non è disponibile, effettuare questo processo utilizzando un bagno di acqua calda, invece.
- Una volta raffreddata a 25 ° C, utilizzare immediatamente la soluzione, o mantenere nel termociclatore (fino a circa 2 h) fino al momento di essereusato. Quando un bagno di acqua viene utilizzata per il riscaldamento, lasciare le provette nel bagno come l'acqua si raffredda lentamente a temperatura ambiente.
3. costruire la curva di fluorescenza taratura e rilevare la presenza di Unchelated Gd 3+ in una soluzione di Gd Agente Contrast
- Sciogliere GdCl 3 solido nel tampone (lo stesso buffer come al punto 2.1).
- Attraverso diluizione in serie, preparare 100 ml ciascuna di 6 diverse soluzioni Gd 3+ in tubi microcentrifuga al doppio delle concentrazioni finali desiderati per la curva di calibrazione (2x soluzioni).
- Ad esempio, per costruire una calibrazione per 0 (tampone solo senza GdCl 3), 50, 100, 200, 400, e 800 nM di Gd 3+, preparare soluzioni contenenti 0, 100, 200, 400, 800, e 1600 nM dello ione. Assicurati di includere sempre il 'vuoto' con 0 ns Gd 3+ come il controllo negativo.
- Sciogliere il mezzo di contrasto per essere provaDE al tampone. Preparare 2 o 3 diverse concentrazioni delle soluzioni di contrasto tramite diluizione in serie.
NOTA: Test 3 diverse concentrazioni della soluzione di agente di contrasto è raccomandato. Questo per garantire che queste concentrazioni sono all'interno del range lineare. Se i campioni esaminati non presentano un rapporto lineare, ridurre le concentrazioni di agente di contrasto utilizzato. - Prendere le provette PCR contenente la soluzione 2x Gd-sensore dal punto 2.5 del termociclatore.
- Aggiungere 50 ml di ciascuna soluzione Gd 3+ dal punto 3.2 in 6 delle provette PCR 9 contenente la soluzione 2x Gd-sensore. Mescolare pipettando su e giù. Ogni tubo PCR contiene ora la concentrazione desiderata di Gd 3+ da testare, 100 nM Gd-aptamer, e 200 nM QS.
- Per le provette PCR restanti contenenti la soluzione Gd-sensore 2x, aggiungere 50 ml delle soluzioni di contrasto dal punto 3.3. Mescolare bene pipettando su e giù un paio di volte.
- Incubare le solutions nei tubi PCR per circa 5 min a temperatura ambiente. Essi possono essere lasciati riposare per un massimo di 30 min.
- Trasferire 45 ml di ciascun tubo in una piastra da 384 pozzetti. Ogni tubo di PCR darà pozzetti in duplicato.
- Registrare la fluorescenza di ciascun pozzetto su una piastra-reader. Il fluoroforo (FAM) utilizzati per la progettazione Gd-sensore è di eccitazione e di emissione massimi di 495 e 520 nm, rispettivamente, come indicato sul sito web del fornitore. Scegliere opportune lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione o filtri a seconda che la piastra-lettore è monochromator- o filter-based.
- Tracciare il grafico della fluorescenza in unità di fluorescenza arbitrarie (AFU) contro la concentrazione di Gd 3+.
- Tracciare il grafico come il cambiamento di fluorescenza volte contro la concentrazione di Gd 3+. Calcolare la variazione di fluorescenza volte dividendo la AFU di ciascuna concentrazione dal AFU della soluzione 'in bianco' (con 0 nM di Gd 3+). Il cambiamento di fluorescenza piega consentirà di normalization dei risultati, qualora il display AFU alcuni periodica (diversi giorni, ecc) variazioni.
- Confrontare l'emissione di fluorescenza della soluzione contenente l'agente di contrasto e 'blank', che è la soluzione contenente 0 nM GdCl 3 (tampone solo).
NOTA: Una maggiore fluorescenza della soluzione GBCA implica la presenza di unchelated Gd 3+, che può richiedere ulteriore purificazione del mezzo di contrasto. La quantità di unchelated Gd 3+ attuale può essere stimata utilizzando la curva di calibrazione costruita nel punto 3.10 o 3.11.
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Representative Results
Una tipica variazione di fluorescenza della soluzione di Gd-sensore in presenza di unchelated Gd 3+ è mostrato in Figura 2. L'emissione può essere tracciata come la variazione di fluorescenza piega (Figura 2A) o la fluorescenza grezza lettura (Figura 2B) in unità arbitrarie (AFU). Entrambe le trame producono curve di calibrazione molto simili, con un intervallo lineare per le concentrazioni di Gd 3+ inferiore a 1 micron e la saturazione del segnale a> 3 micron. Il limite di rilevazione è di ~ 100 nm con un rapporto segnale-rumore di 3.
In soluzioni contenenti il GBCA di interesse, la presenza di unchelated Gd 3+ si tradurrà in un aumento di fluorescenza del sensore rispetto alla soluzione 'blank'. Le variazioni di fluorescenza in soluzione di 2 differenti lotti di complesso Gd-DOTA, una purezza superiore all'altro, sono esposizionen come esempi di risultati rappresentativi (Figura 3). Gd-DOTA (acido gadoterico) è un complesso di gadolinio di Gd 3+ circondata da un DOTA legante organico che si trova in un agente di contrasto commerciale. Il lotto di elevata purezza non presenta un aumento significativo di emissione fino a 20 mM di Gd-DOTA. Quando unchelated Gd 3+ è presente, si osserva un cambiamento che si nota anche a concentrazioni Gd-DOTA inferiori a 5 mm. In questo esempio dove i punti dati vengono tracciati come cambiamento di fluorescenza piega del sensore, quantificazione della quantità di unchelated Gd 3+ può essere stimata utilizzando la curva di calibrazione della figura 2A.
Figura 2. Rappresentante Gd-sensore di fluorescenza trame curva di calibrazione. Tutti i punti dati sono stati eseguiti almeno nella duplicati e la media valori plotTed con deviazione standard, come le barre di errore. (A) Una curva di calibrazione ottenuta usando 100 nM Gd-aptamer e 200 nM QS. Il grafico è tracciata con il cambiamento di fluorescenza piega come asse y. (B) La stessa curva di calibrazione come in (A) con la fluorescenza grezza in unità arbitrarie (AFU) come asse y. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rappresentante cambiamento Gd-sensore di fluorescenza quando si verifica la presenza di unchelated Gd 3+ in campioni di Gd-DOTA molecola. Due diversi lotti di soluzioni complesse Gd-DOTA sono mostrati in questa trama, uno dei più elevata purezza (marcatore cerchio) e l'altra contenente unchelated Gd 3+ (Triangl blue marcatore). Ciascun punto di dati rappresenta una media di due letture con deviazione standard come le barre di errore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando il Gd-sensore aptameri base, un aumento di emissione di fluorescenza che è proporzionale alla concentrazione di unchelated Gd 3+ è osservato. Per ridurre al minimo la quantità di campione usato, il saggio può essere eseguito in 384 pozzetti micropiastra con un volume di campione totale di 45 microlitri per pozzetto. In questo disegno, la scelta di fluoresceina (FAM) e DABCYL (Dab) è basata principalmente sul costo dei reagenti; modificare la lunghezza d'onda di emissione, un diverso accoppiamento di fluoroforo e quencher può essere utilizzato 11.
E 'importante notare che per ottenere il miglior risultato con il sensore, una delle fasi critiche è il riscaldamento a 95 ° C e raffreddamento lento (passo 2.4) nel tampone di raggiungere ibridazione ottimale tra il Gd-aptamer e QS filoni. Come precedentemente menzionato nel protocollo, se un termociclatore non è disponibile, l'incubazione a 95 ° C può essere effettuata in un bagno d'acqua. Un altro parametro chiave per il controllo è tegli composizioni delle soluzioni tampone; Si consiglia l'uso del tampone elencato nel passaggio 2.1 per sciogliere l'agente di contrasto, o acqua deionizzata può anche essere usato. Tuttavia, le soluzioni contenenti potenziali interferenti dovrebbero essere evitati. Un esempio di tale buffer è quello che contiene anioni fosfato, quale può coordinare al unchelated Gd 3+ per formare insolubile gadolinio fosfato 12. Il precipitato non reagisce con il sensore, determinando un risultato falso negativo.
A pochi passi negli esperimenti possono essere modificati senza influenzare il risultato. Innanzitutto, per semplificare l'analisi e calcolo, preparare sia la soluzione Gd-sensore e acquosa GdCl 3 per la curva di taratura a concentrazioni 2x. Se lo si desidera, altri fattori di diluizione possono essere utilizzati (per esempio, 10x soluzioni), a condizione che le concentrazioni di saggio finali del Gd-aptamer e QS sono mantenuti a 100 nM e 200 nM, rispettivamente. In secondo luogo, il tampone del saggio dOES non devono essere esattamente pH 7,4. Qualsiasi valore compreso tra 7 - 7.4 produrrà l'aumento di fluorescenza desiderato, purché lo stesso buffer è usata durante tutto l'esperimento. In terzo luogo, una volta che si ottiene la lettura emissione di fluorescenza, i punti di dati possono essere tracciati o come la fluorescenza prima in unità arbitrarie (AFU) o come variazione di fluorescenza volte. Per calcolare la variazione di fluorescenza piega, la lettura di fluorescenza crudo di ciascuna concentrazione è normalizzata (diviso per) la lettura del controllo negativo (0 nM Gd 3+). Come mostrato nelle figure 2A e B, le tendenze di emissione di fluorescenza in entrambi trame sono quasi identici. Il cambiamento piega può essere un modo più conveniente per analizzare i dati se il lettore di piastre mostra alcune variazioni nelle letture elaborati registrati in momenti diversi. Infine, se il laboratorio è dotato di un fluorimetro, ma non un lettore di piastre, ciascun punto di dati può essere misurata usando una cuvetta, invece di una micropiastra. A seconda delle dimensioni of le cuvette disponibili, potrebbe essere necessario regolare i volumi delle soluzioni preparate nel test.
Il metodo qui riportate fornisce un'alternativa alla chromatographic- e / o tecniche di spettrometria a base acquosa per rilevare Gd 3+. Rispetto a quest'ultimo, il saggio Gd-sensore è più limitato in termini di sensibilità, la precisione e la capacità per il rilevamento simultaneo di più specie. D'altra parte, il sensore spettroscopica-based richiede una strumentazione che possono eventualmente essere più facilmente disponibili, può essere eseguita entro un periodo di tempo più breve, e la preparazione del campione è minima. L'agente di contrasto può essere semplicemente sciolto in soluzione tampone, miscelata con la soluzione Gd-sensore, e l'emissione di fluorescenza misurata direttamente. Inoltre, il sensore è in grado di rilevare una molto più bassa concentrazione di unchelated Gd 3+ che l'indicatore xilenolo arancio (circa 2 ordini di grandezza differenza tra i due metodi) e ha unmaggiore selettività per Gd 3+ nell'arco di diversi altri ioni metallici biologicamente importanti e di transizione 9.
Ci sono due inconvenienti di questo test che possono limitarne l'uso in alcune condizioni sperimentali. Una limitazione è che il sensore non è specifico per Gd 3+; visualizza una risposta ad altri ioni lantanidi (come Eu 3+ e Tb 3+) 9. Tuttavia, questi non sono ioni trovano comunemente in agenti di contrasto o sistemi biologici e, quindi, la loro interferenza sono minime. Il secondo punto da notare è che a concentrazioni elevate (sopra ~ 10 mM) di Gd 3+, una graduale diminuzione della emissione di fluorescenza Gd-sensore è osservata. L'effetto di tempra da ioni lantanidi è un fenomeno ben documentato 13 che è stato usato anche come una tecnica per rilevare e quantificare le 14. Mentre questo limita l'utilità del sensore per la misura di concentrazioni elevate di Gd 3+
In questo lavoro, l'uso di una comoda tecnica basato sulla fluorescenza per rilevare tossici unchelated Gd 3+ in soluzione acquosa è stato descritto. Questo test è pensato per la valutazione fase iniziale di gadolinio a base di purezza mezzo di contrasto, in particolare durante la sintesi e la formulazione per gli esperimenti in vitro. Con l'attuale crescita della risonanza magnetica nella diagnosi, un numero crescente di agenti di contrasto nuovi sono continuamente progettati e testati. Il Gd-sensore aptameri basati faciliterà questo sviluppo fornendo un mezzo per rapidamente rilevare la presenza di concentrazioni sub-micromolare di non reagito o dissociata Gd 3+ in soluzione acquosa a pH ambiente. Inoltre, poiché il sensore visualizzi cross-reattività con altri ioni trivalenti lantanidi, la sua applicazione può essereestesa a queste aree di ricerca.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
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