Unchelated 가돌리늄위한 앱 타머 기반 센서 (III)

Summary

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Abstract

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 – 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Introduction

기술의 고유의 감도에 의해 제한된다 임상 진단에서 자기 공명 영상 (MRI)의 중요성이 증가는 신규 가돌리늄 계 조영제 (GBCAs ^1)의 개발에 대한 연구의 빠른 성장을 가져왔다. GBCAs은 이미지 품질을 개선하기 위해 투여되는 분자이며, 그들은 일반적으로 여러 자리 리간드에 배위 3가 가돌리늄 이온 (하나님 ^3+)의 화학 구조를 갖는다. 이 복합체는 독성 ³⁺ unchelated 하나님으로 매우 중요합니다; 이는 신장 질환 또는 ^장애이 일부 환자에서 신원 성 전신 섬유증의 발병과 연관되어있다. 따라서, 수성 자유 이온을 검출하는 GBCAs의 안전을 확보하는 수단이있다. GBCA 솔루션 unchelated 하나님 ^3+의 존재는 종종 리간드 및 이온 복합체의 해리 또는 displacemen 간의 불완전한 반응의 결과다른 생물학적 금속 양이온 ^(3)에 의한 t.

현재 하나님 ^3+, 융통성 및 적응성 ^(4)의 측면에서 크로마토 그래피 및 / 또는 분광 최고 순위를 의존들의 존재를 결정하기 위해 사용하는 여러 기술 중. 강점 중 높은 감도 및 정확도 (리스트를, 복수 하나님 ³⁺ 복합체의 동시 정량 (인간 혈청 ⁵ 소변 헤어 ⁶ 폐수 ⁷ 및 조영제 제제 ^{8 등)} 다양한 시료 매트릭스를 분석하는 능력이다 연구의 2013 년 이전은 Telgmann 등.) ^(4)에 의해 종합적인 검토에 설명되어 있습니다. 유일한 단점은 이들 방법 중 몇몇은 몇몇 실험실에 액세스 할 수있다 (예 : 유도 결합 플라즈마 질량 분석)을 측정 장치 ^{(4)를 필요로한다는} 것이다. 연구 및 개념 증명 수준 AR에 참신한 GBCA 검색의 맥락elatively 더욱 편리하고 신속하고 비용 효율적인 분광 기반 방법 (예 : 비스 – UV 흡수 또는 형광 등) 유용한 대안이 될 수있다. 마음에 이러한 응용 프로그램으로, 수성 하나님 ^3+에 대한 형광 앱 타머 기반 센서 ^(9)을 개발 하였다.

앱 타머 (GD-앱 타머)는 지수 농축 (SELEX) ^(9)에 의한 리간드의 체계적인 진화의 과정을 통해 분리하여 염기의 특정 순서와 44 염기 길이의 단일 가닥 DNA 분자이다. 형광 센서에 앱 타머에 적응하기 위해, 형광 물질은 13 상보적인 염기 (도 1)를 통해 급냉 스트랜드 (QS)와 혼성화되는 가닥의 5 '말단에 부착된다. QS는 3 '말단에 어두운 소광 분자 태그입니다. 1 이루어지는 하나님 ³⁺ 센서 (GD-센서)의 부재에있어서 : 각각 GD-앱 타머 및 QS 2 몰비 최소 형광 방출 인해 t있을 것이다소광에 형광에서 오 에너지 전달. 수성 하나님 ^3+의 첨가는 형광 방출 증가의 결과로, GD-앱 타머에서 QS를 대체 할 것이다.

형광 (형광)과 dabcyl 태그로 13베이스 긴 담금질 가닥 (QS) 태그로 44베이스 긴 앱 타머 (GD-앱 타머) (어두운 소광)로 구성되어 그림 1. 센서 (하나님 센서) . unchelated 하나님 ^3+의 부재에서, 센서의 형광이 최소이다. 하나님 ^3+의 첨가에 의해, QS의 변위가 발생하고, 형광 발광의 증가가 관찰된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

현재 존재 한 일반적으로 사용되는 광학적 기반 방법에 대한 검출수성 하나님의 ^{3 이상을} 보내고. 이 분석은 이온 ¹⁰ 킬에 따라 433 nm의 573에서 최대 흡수 파장의 변화를 겪는다 분자 크 실레 놀 오렌지를 사용합니다. 이들 두 흡수 최대 값의 비율은 unchelated 하나님 ^3+의 양을 정량화 할 수있다. 두 가지 방법은, 타겟 선택도, 정량 분석의 선형 범위 및 검출 양상 (예 : pH 및 사용되는 버퍼 용액의 조성과 같은) 상이한 반응 조건을 가지고, 상기 앱 타머 센서는 크 실레 놀 오렌지 분석에 대한 대안 (또는 보완 될 수있다)는 ^9.

Protocol

참고 : 분자 생물학 수준의 물이 모든 버퍼 및 솔루션 준비에 사용됩니다. 모든 일회용 튜브 (마이크로 원심과 PCR) 및 피펫 팁 DNase-과의 RNase-무료입니다. 사용하기 전에 모든 화학 물질에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 사용하는 것이 좋습니다. 앱타 머는 재고 솔루션 1. 준비 상업적으로 polydeoxynucleotide의 2 가닥을 구입?…

Representative Results

unchelated 하나님 3+의 존재 GD-센서 용액의 전형적인 형광 변화는도 2에 도시되어있다. 방출은 형광 배 변화 (그림 2A) 또는 임의의 단위로 읽기 원시 형광 (그림 2B)로 나타내 어질 수 (AFU). 두 플롯> 3 μM에서 신호의 1 μM 및 채도 아래 하나님의 농도에 대한 선형 범위 3+와 매우 유사 교정 곡선을 얻었다. 검출 한계는 3 신?…

Discussion

앱타 머는 기반 GD-센서 관측 unchelated 하나님 ^3+의 농도에 비례하는 형광 방출의 증가 사용. 사용한 시료의 양을 최소화하기 위해, 분석은 웰 당 45 μL의 총 샘플 부피의 384 웰 마이크로 플레이트에서 실행될 수있다. 이 설계에서, 플루오 레세 인 (FAM) 및 dabcyl DAB ()의 선택은 주로 시약의 비용에 기초 하였다 발광 파장, 형광의 다른 쌍을 수정 및 소광 제 ^(11)를 사용할 수있다.

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Materials

Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 – 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with  0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Name of Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well