Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

Summary

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Abstract

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 – 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Introduction

Die zunehmende Bedeutung der Kernspintomographie (MRI) in der klinischen Diagnose, die durch die inhärente Empfindlichkeit der Technik begrenzt ist, hat in dem schnellen Wachstum der Forschung in die Entwicklung von neuartigen Gadolinium-Kontrastmitteln (GBCAs) ¹ geführt. GBCAs sind Moleküle , die verabreicht werden , um die Bildqualität zu verbessern, und sie haben typischerweise die chemische Struktur eines dreiwertigen Gadolinium – Ion (Gd ³⁺⁾ zu einem mehrzähnigen Liganden koordiniert. Diese Komplexbildung ist von entscheidender Bedeutung , da unchelatisierten Gd ³⁺ ist giftig; es wurde bereits ² in der Entwicklung von nephrogener systemische Fibrose bei einigen Patienten mit Nierenerkrankung oder Versagen gebracht. Folglich wird die wäßrige freie Ionen Erfassungs dazu bei, die Sicherheit der GBCAs gewährleisten. Die Anwesenheit von unchelatisierten Gd ³⁺ in GBCA Lösungen ist oft das Ergebnis einer unvollständigen Reaktion zwischen dem Liganden und dem Ion, Dissoziation des Komplexes oder displacement durch andere biologische Metallkationen ^3.

Unter den verschiedenen Techniken , die derzeit zur Bestimmung der Anwesenheit von Gd ^3+, diejenigen , die sich auf Chromatographie und / oder Spektrometrie Rang höchsten in Bezug auf Vielseitigkeit und Anwendbarkeit ^4. Unter ihren Stärken sind eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit, die Fähigkeit , verschiedene Matrices (einschließlich humanem Serum ^5, Urin und Haar ^6, Abwasser ⁷ und Kontrastmittelformulierungen ⁸⁾ und die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Gd ³⁺ Komplexe (eine Auflistung zu analysieren vor dem Jahr 2013 von Studien in einer umfassenden Überprüfung von Telgmann et al.) ^4. Der einzige Nachteil ist , dass mehrere dieser Verfahren erfordern Instrumentierungen (wie induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie) ⁴ , dass einige Laboratorien haben möglicherweise keinen Zugriff auf. Im Rahmen der neuen GBCA Entdeckung an der Forschung und Proof-of-Concept-Ebenen, arelatively bequemer, schneller und kostengünstiger spektroskopischen-basierte Verfahren (wie UV-Vis-Absorption oder Fluoreszenz) kann als eine wertvolle Alternative dienen. Mit diesen Anwendungen im Blick, ein fluoreszierendes Aptamer-basierten Sensor für wässrige Gd ³⁺ wurde ⁹ entwickelt.

Das Aptamer (Gd-Aptamer) ist ein 44-Basen langen einzelsträngigen DNA – Moleküls mit einer bestimmten Sequenz von Basen , die durch den Prozess der systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ⁹ isoliert. Um das Aptamer in einen Fluoreszenzsensor anzupassen, ein Fluorophor an das 5' – Ende des Stranges befestigt sind , die dann mit einem Quenching Strang (QS) über 13 komplementären Basen (Abbildung 1) hybridisiert ist. Der QS ist mit einem dunklen Quencher-Molekül am 3'-Terminus markiert. In der Abwesenheit von Gd ^3+, dem Sensor (Gd-Sensor), einer 1 umfasste: 2 – Molverhältnis von Gd-Aptamer und QS bzw. haben, minimale Fluoreszenzemission aufgrund to Energieübertragung von dem Fluorophor zu dem Quencher. Die Zugabe von wässrigem Gd ³⁺ das QS vom Gd-Aptamer, was zu einem Anstieg in der Fluoreszenzemission verdrängen.

Abbildung 1. Der Sensor (Gd-Sensor), der mit Fluorescein (ein Fluorophor) und dem langen Lösch Strang (QS) getaggt mit Dabcyl (ein dunkler Löscher) 13-Basis (Gd-Aptamer) markiert 44-base lange Aptamer besteht . In Abwesenheit von unchelatisierten Gd ^3+, die Fluoreszenz des Sensors ist minimal. Mit Zugabe von Gd ^3+, Verschiebung des QS auftritt und eine Erhöhung der Fluoreszenzemission beobachtet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Es ist derzeit, eine häufig verwendete spektroskopische basiertes Verfahren zur Erkennunging wässrigen Gd ^3+. Dieser Assay verwendet das Molekül Xylenolorange, die 433 bis 573 nm auf Chelatisierung an die Ionen ¹⁰ eine Verschiebung der maximalen Absorptionswellenlänge unterzogen wird . Das Verhältnis dieser zwei Absorptionsmaxima können verwendet werden , um die Menge des unchelatisierten Gd ³⁺ zu quantifizieren. Das Aptamer Sensor ist eine Alternative (kann auch komplementär sein) an den Xylenolorange-Test, als die beiden Verfahren unterschiedliche Reaktionsbedingungen (wie beispielsweise pH und der Zusammensetzung der Pufferlösungen verwendet wird) haben, Ziel Selektivitäten, linearen Bereichen der Quantifizierung und Erfassungsmodalitäten ^9.

Protocol

HINWEIS: die Molekularbiologie Wasser wird in allen Puffer und Lösungs-Präparate eingesetzt. Alle Einweg-Röhrchen (Mikro und PCR) und Pipettenspitzen sind DNase- und RNase-frei. Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für alle Chemikalien vor der Verwendung. Einsatz einer persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wird dringend empfohlen. 1. Herstellung der Stammlösungen Aptamer kommerziell Kauf 2 Stränge von Polydesoxynukleotid-. Um beide Stränge mit Reinigung durch…

Representative Results

Eine typische Fluoreszenzänderung des Gd-Sensorlösung in Gegenwart von unchelatisierten Gd 3+ ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Emission kann als die Fluoreszenz – fache Veränderung (2A) oder die rohe Fluoreszenzablesen (2B) in willkürlichen Einheiten aufgetragen werden (AFU). Beide Diagramme ergeben sehr ähnliche Eichkurven mit einem linearen Bereich für die Konzentration von Gd 3+ unter 1 & mgr; M und …

Discussion

Verwendung der Aptamer-basierten Gd-Sensor, ein Anstieg in der Fluoreszenzemission , die auf die Konzentration des unchelatisierten Gd ³⁺ proportional ist beobachtet wird . Um die Menge der Probe zu minimieren verwendet wird, kann der Test in einem 384-Well-Mikroplatten mit einer Gesamtprobenvolumen von 45 & mgr; l pro Vertiefung ausgeführt werden. In dieser Konstruktion ist die Wahl von Fluorescein (FAM) und DABCYL (Dab) wurde auf die Kosten der Reagenzien basieren in erster Linie; die Emissionswellenl?…

Materials

Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 – 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with  0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Name of Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well