Viene descritto l'uso di molecole di polideossinucleotide (aptamero 44-mer) per rilevare lo ione gadolinio (III) non chelato in una soluzione acquosa. La presenza dello ione viene rilevata tramite un aumento dell'emissione di fluorescenza del sensore.
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Articolo metodologico
Un sensore Aptamero-based per Unchelated gadolinio (III)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Viene dimostrato un metodo per determinare la presenza di ione gadolinio trivalente non chelato (Gd3+) in soluzione acquosa. Gd3+ è spesso presente in campioni di mezzi di contrasto a base di gadolinio a seguito di reazioni incomplete tra il ligando e lo ione, o come prodotto di dissociazione. Poiché lo ione è tossico, la sua rilevazione è di fondamentale importanza. Qui vengono descritti la progettazione e l'utilizzo di un sensore basato su aptamero (sensore Gd) per Gd3+. Il sensore produce una variazione di fluorescenza in risposta all'aumento delle concentrazioni dello ione e ha un limite di rilevamento nell'intervallo nanomolare (~100 nM con un rapporto segnale/rumore di 3). Il test può essere eseguito in un tampone acquoso a pH ambiente (~7 - 7,4) in una micropiastra a 384 pozzetti. Il sensore è relativamente poco reattivo nei confronti di altri ioni metallici fisiologicamente rilevanti come gli ioni sodio, potassio e calcio, sebbene non sia specifico per Gd3+ rispetto ad altri lantanidi trivalenti come l'europio(III) e il terbio(III). Tuttavia, i lantanidi non si trovano comunemente negli agenti di contrasto o nei sistemi biologici e il sensore può quindi essere utilizzato per determinare selettivamente il Gd3+ non chelato in condizioni acquose.
Introduzione
La crescente importanza della risonanza magnetica (MRI) nella diagnosi clinica, che è limitata dalla sensibilità intrinseca della tecnica, ha portato alla rapida crescita della ricerca per lo sviluppo di nuovi agenti di contrasto a base di gadolinio (GBCAs) 1. GBCAs sono molecole che vengono somministrati per migliorare la qualità dell'immagine, e che in genere hanno la struttura chimica di uno ione trivalente gadolinio (Gd 3+) coordinato ad un ligando polidentato. Questa complessazione è di importanza critica come unchelated Gd 3+ è tossico; essa è stata implicata nello sviluppo di fibrosi sistemica nefrogenica in alcuni pazienti....
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Protocollo
NOTA: l'acqua di biologia molecolare di grado è utilizzato in tutte le preparazioni tampone ed una soluzione. Tutti i tubi monouso (microcentrifuga e PCR) e puntali sono DNase- e RNase-free. Si prega di consultare la scheda di sicurezza (SDS) per tutte le sostanze chimiche prima dell'uso. L'utilizzo di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) è fortemente raccomandato.
1. Preparazione dei aptamero archivio Solutions
- Acquisto 2 basi di polydeoxynucleotide commercio. Ordinare entrambi i filamenti con purificazione tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
Parte 1 (Gd-aptamero):
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Risultati
Una tipica variazione di fluorescenza della soluzione di Gd-sensore in presenza di unchelated Gd 3+ è mostrato in Figura 2. L'emissione può essere tracciata come la variazione di fluorescenza piega (Figura 2A) o la fluorescenza grezza lettura (Figura 2B) in unità arbitrarie (AFU). Entrambe le trame producono curve di calibrazione molto simili, con un intervallo lineare per le concentrazioni di Gd 3+ inferiore a .......
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Discussione
Utilizzando il Gd-sensore aptameri base, un aumento di emissione di fluorescenza che è proporzionale alla concentrazione di unchelated Gd 3+ è osservato. Per ridurre al minimo la quantità di campione usato, il saggio può essere eseguito in 384 pozzetti micropiastra con un volume di campione totale di 45 microlitri per pozzetto. In questo disegno, la scelta di fluoresceina (FAM) e DABCYL (Dab) è basata principalmente sul costo dei reagenti; modificare la lunghezza d'onda di emissione, un diverso accoppiame.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Milan N Stojanovic della Columbia University, New York, NY per il prezioso contributo scientifico. Questo lavoro è supportato da finanziamenti della California State University East Bay (CSUEB) e del CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C. e A.L. sono stati supportati dalla borsa di studio del CSUEB Center for Student Research (CSR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| IDTDNA | Sequenza di input e modifica del fluoroforo nella forma d'ordine | Può essere utilizzato un fluoroforo con una diversa lunghezza d'onda di emissione. L'aptamero può essere ordinato anche da un'altra azienda. | |
| Filamento di quenching | IDTDNA | Sequenza di input e modifica del quencher nella forma d'ordine | È possibile utilizzare un quencher diverso per un trasferimento ottimale di energia dal fluoroforo. L'aptamero può essere ordinato anche da un'altra azienda. |
| di grado di biologia molecolare | Nessun produttore specifico, sia il DEPC che il non DEPC trattato funzionano ugualmente bene | ||
| Cloruro di gadolinio (III) anidro | Strem | 936416 | tossico |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Cloruro di magnesio anidro | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Cloruro di sodio | Acros Organics | ||
| Cloruro di potassio | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Idrossido di sodio, pellet | Fisher Scientific | BP359 | Corrosivo |
| Acido cloridrico | Fisher Scientific | SA49 | Tossico e corrosivo |
| 384 pozzetti a flangia bassa nero fondo piatto Piastre NBS | Corning | 3575 | Piastre adatte per la fluorescenza lettura sono obbligatorie. |
| Nalgene Filtro sterile monouso per flaconi Nalgene | Thermo Scientific | 5680020 | Il tappo del flacone è dotato di membrana PES da 0,2 micron |
| Flaconi sterili monouso da 250 mL | Corning | 430281 | È possibile utilizzare un flacone più grande o più piccolo |
| Provette | Nessun produttore specifico, purché siano | ||
| provette | per PCR da 0,2 mL prive di DNAsi e RNAsiNessun produttore specifico, purché siano | ||
| Punte per pipette (non filtranti) di dimensioni | Nessun produttore specifico, purché prive di DNAsi e RNAsi | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | I lettori di lastre di altri produttori funzionerebbero altrettanto bene |
Riferimenti
- Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).
- Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for car....
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Ristampe e permessi
