An-aptameergebaseerde Sensor voor Unchelated Gadolinium (III)

Summary

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Abstract

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 – 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Introduction

Het toenemende belang van magnetic resonance imaging (MRI) in klinische diagnose, die wordt begrensd door de inherente gevoeligheid van de techniek heeft geleid tot de snelle groei van het onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe gadolinium gebaseerde contrastmiddelen (GBCAs) ^1. GBCAs zijn moleculen die worden toegediend om de beeldkwaliteit te verbeteren, en zij hebben meestal de chemische structuur van een trivalent ion gadolinium (Gd ³⁺⁾ gecoördineerd aan een meertandige ligand. Dit complexatie is van cruciaal belang als unchelated Gd ³⁺ is giftig; Het is betrokken bij de ontwikkeling van nefrogene systemische fibrose bij sommige patiënten met nierziekte of mislukking ^2. Bijgevolg, het detecteren van de waterige vrije ion is behulpzaam bij het waarborgen van de veiligheid van GBCAs. De aanwezigheid van unchelated Gd ³⁺ in GBCA oplossingen vaak het gevolg van een onvolledige reactie tussen het ligand en de ionen dissociatie van het complex, of displacement door andere biologische metaalkationen ^3.

Onder de verschillende technieken die momenteel gebruikt om de aanwezigheid van Gd ^3+, die berusten op chromatografie en / of spectrometrie hoogste rang qua veelzijdigheid en toepasbaarheid ^4. Onder hun sterke punten zijn hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid, de mogelijkheid om verschillende matrices (inclusief humaan serum ^5, urine en haren ^{6, 7} afvalwater en contrastmiddel formuleringen ⁸⁾ en de gelijktijdige kwantificering van meervoudige Gd ³⁺ complexen een bedrijf ervan ( van studies voorafgaand aan 2013 wordt beschreven in een algehele herziening van Telgmann et al.) ^4. Het enige nadeel is dat een aantal van deze methoden vereisen instrumentatie (bijvoorbeeld inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie) ⁴ dat sommige laboratoria geen toegang kunnen krijgen. In het kader van nieuwe GBCA ontdekking in het onderzoek en de proof-of-concept niveau, arelatively gemakkelijker, sneller en kosteneffectieve spectroscopische gebaseerde methode (zoals UV-Vis absorptie of fluorescentie) kan dienen als een waardevol alternatief. Met deze toepassingen in het achterhoofd, een fluorescent-aptameergebaseerde sensor voor waterige Gd ³⁺ werd ontwikkeld ^9.

De aptameer (Gd-aptameer) is een 44-base lange enkelstrengs DNA-molecuul met een specifieke sequentie van basen die werd geïsoleerd door het proces van systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) ^9. De aptameer te vormen tot een fluorescerende sensor, wordt een fluorofoor aan het 5'-uiteinde van de streng, die vervolgens gehybridiseerd met een quenching streng (QS) via 13 complementaire basen (figuur 1) bevestigd. Het QS is gelabeld met een donkere quenchermolecuul op de 3 'terminus. Aangezien Gd ^3+, de sensor (Gd-sensor), bestaande uit een 1: 2 respectievelijk molverhouding van Gd-aptameer en QS, zal een minimale fluorescentie-emissie als gevolg to energieoverdracht van de fluorofoor naar de onderdrukker. De toevoeging van waterig Gd ³⁺ zal de QS verplaatsen van de Gd-aptameer, resulterend in een toename in fluorescentie-emissie.

Figuur 1. De sensor (Gd-sensor), die bestaat uit de 44-voet lange aptameer (Gd-aptameer) getagged met fluoresceïne (een fluorofoor) en de 13-voet lange blussen streng (QS) getagged met DABCYL (een donkere quencher) . Aangezien unchelated Gd3 ⁺ de fluorescentie van de sensor is minimaal. Onder toevoeging van Gd ^3+, verplaatsing van de QS optreedt en een toename in fluorescentie-emissie waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Er is op dit moment, een veelgebruikte-spectroscopische methode voor het detecterening waterige Gd ^3+. Deze test maakt gebruik van het molecuul xylenol oranje, die een verschuiving van de maximale absorptiegolflengte 433-573 nm bij chelatie het ion ¹⁰ ondergaat. De verhouding van deze twee absorptiemaxima kan worden gebruikt om de hoeveelheid unchelated Gd ³⁺ kwantificeren. De aptameer sensor een alternatief (ook complementair zijn) aan de xylenol oranje assay, zoals de twee methoden hebben verschillende reactiecondities (zoals pH en samenstelling van de bufferoplossingen gebruikt), doel selectiviteit, lineaire reeksen van kwantificering en detectie voorwaarden ^9.

Protocol

OPMERKING: Moleculaire biologie kwaliteit water wordt gebruikt in alle buffer en oplossing preparaten. Alle disposable buizen (microcentrifuge en PCR) en pipet tips zijn DNase- en RNase-vrij. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (VIB) voor alle chemische stoffen voor gebruik. Het gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) wordt sterk aanbevolen. 1. Bereiding van de aptameer Voorraadoplossingen Aankoop van 2 strengen van polydeoxynucleotide commercieel. Bestel…

Representative Results

Een typische fluorescentieverandering van het Gd-sensor oplossing in de aanwezigheid van unchelated Gd 3+ is weergegeven in figuur 2. De emissie kan worden uitgezet als de fluorescentie-voudige verandering (figuur 2A) of de rauwe fluorescentie lezing (Figuur 2B) in willekeurige eenheden (AFU). Beide percelen opbrengst vergelijkbaar kalibratiekrommen met een lineaire bereik voor de concentratie van Gd 3+ dan 1 pM en …

Discussion

Met behulp van de aptameergebaseerde Gd-sensor, een toename in fluorescentie-emissie die evenredig is met de concentratie van unchelated Gd ³⁺ waargenomen. Om de hoeveelheid van het monster gebruikt een minimum te beperken, kan de test worden uitgevoerd in een 384-wells microplaat met een totale steekproef volume van 45 ul per putje. In dit ontwerp, is de keuze van fluoresceïne (FAM) en DABCYL (Dab) voornamelijk gebaseerd op de kosten van de reagentia; de emissiegolflengte een andere koppeling van fluorofoor…

Materials

Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 – 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with  0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Name of Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well