Summary
koşullu yeniden programlamayı kullanarak insan pediatrik özofagus epitel hücrelerinin genişlemesi kusurları veya yaralanma tedavi ve tedavi amaçlı testler için bir rezervuar olarak hizmet otolog implantasyon için özofagus yapıları mühendislik için kullanılabilir hücrelerin hastaya özgü nüfusa sahip araştırmacılar sağlar.
Introduction
Özofagus doku mühendisliği ve eozinofilik özofajit (EÖ) son on yılda pek çok laboratuvarda araştırma odağı olmuştur. Böyle özofagus atrezisi gibi konjenital defektler, 1 yemek yetersizlik önde gelen yemek borusu eksik gelişmesi ile sonuçlanır yaklaşık 1 4,000 canlı doğumda, görülür. EÖ insidans ve prevalansının 1993 yılında hastalık varlığın kimlik EÖ insidansı 10 kişi-yıl başına / 100,000 0.7 arasında değiştiği ve yaygınlık 43 / 100,000 2 0.2 arasında değişmektedir beri artış olmuştur. çok uzun aralıklı özefagus atrezisi tedavisi için yeni bir çekici cerrahi yaklaşım hastanın kendi hücrelerini kullanarak implantasyon için doku yapıları üreten oluşur. Sentetik iskele ile bağlantılı olarak bu hücreler bağışıklık bastırma gerektirmeyen bir otolog yapı oluşturur. Bazı gruplar zaten bizi araştırmaya başlamışlardır7 - özofagus doku mühendisliği 3 yanı sıra yerli özofagus epitel hücrelerinin kullanımı için kök benzeri hücreler e mukozasında 4 yeniden doldurmak için. pediatrik hastaların yemek borusunda mevcut hastalıklar sıklıkla teşhis ya da müdahale olmadan çalışmaya zordur. Ayrıca, kullanan hayvan modelleri ya da in vitro tam hastalık patogenezi veya hasta belirli farklılıklar 8 kapsayacak yok EÖ gibi pediatrik hastalıklar için hücre hattı modelleri ölümsüzleştirdi. Bu nedenle, sırayla in vitro bir hastanın hastalık sürecini incelemek için yetenek, spesifik hastalık tetikleme antijenleri tespit yatan mekanizmaları değerlendirmek ve roman ve hasta tedavisinde yardımcı olabilecek bilgiler klinisyenlere sağlayacak ilaç tedavileri araştırmak için.
Tissu'nun kullanılmak için önerilmiştir, birçok otolog veya hasta açısından spesifik hücre tipleri olmuşture mühendisliği ve insan hastalık patogenezini okuyan. Bununla birlikte, bu hücre tiplerinin, bazı büyük iskele tohum ya da in vitro çalışmalarda yüksek verim gerçekleştirmek için belirli bir fenotip yeterli hücre oluşturmak için kendi yeteneği sınırlıdır. Pluripotent veya multipotent kök hücrelerin kullanımı çok araştırma tartışma konusu olmuştur, ancak bu hücrelerin kullanımı için sınırlamalar ve eksiklikleri de 9 tarif edilmiştir. İnsan embriyonik kök hücrelerin kullanımı çok tartışılan ve birçok etik sorunlar karşımıza çıkar. En önemlisi, bu hücrelerin kendi pluripotent devletten önce yaşayan bir ev sahibi 10 içine sunmaya ayırt değilse, bir tümöre benzer teratom oluştururlar. Ayrıca, embriyonik kök hücrelerin kullanımı hastaya özgü olmaz ve bir allojenik tepki ve bağışıklık baskılanması 10 ihtiyacını ortaya olabilir. Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) o can pluripotent hücrelerdirhastanın kendi hücreleri elde edilebilir. örneğin deri hücreleri gibi somatik hücreler, birleştirici ve bütünleştirici olmayan çeşitli teknikler kullanılarak pluripotent duruma indüklenebilir. Bu hücreler daha sonra, doku mühendisliği ya da hastalık inceleme için hastaya özel hücre kaynakları olarak görev yapar. Bu hücrelerin içine istenmeyen genetik materyalin entegrasyonu birçok tarif var ve diziler bile tamamen kaldırıldı iPSCs onlar 11 türetildikleri hücre tipine karşı bir epigenetik "hafıza" korumak için görünen bir husustur. Transplantasyon 11 öncesinde farklılaşmış takdirde Bu hücreler, aynı zamanda in vivo olarak teratomlar oluşturacaktır. Bir çok farklılaşma protokolleri ancak, farklılaşma sonunda elde edilen hücre tipi homojen ve O değildir dikkat etmek önemlidir, epitel soy, 12, 13, 14 odaklanan incelenmiştirnly ilgi hücre tipinin bir bölümünü sahiptirler. Bu düşük verim ve istenen hücre türü arındırmak için ihtiyacı ile sonuçlanır. iPSCs potansiyel hastaya özgü hücre kaynağı olsa da, proses doku mühendisliği veya hastalık araştırma biri için ilgi konusu bir hücre tipi çok yetersiz elde edildi.
Akciğer 15, meme 16, ince bağırsak, 17 kolon 18, mesane 19 ve yemek borusu 20: insan epitelyum hücrelerinin başarılı dahil olmak üzere insan vücudunda hastalıklı olmayan hastalıklı doku hem de çeşitli izole edilmiştir. İnsan birincil hücreler fenotipik 21, 22 muhafaza edildiği geçitlerin sonlu sayıda olduğunu not etmek önemlidir. Ne yazık ki, bu demektir ki bir hastalık inceleme ya da bir mühendislik iskele tohumlama için gereken hücre sayısıimplantasyon için elde edilemez. Bu nedenle, yeni teknikler de epitel fenotipi muhafaza ederken, hastanın hücreleri genişletmek için ihtiyaç vardır. Besleyici hücreler ve kaya inhibitörü yararlanarak normal ve kanserli epitel hücrelerinin koşullu yeniden programlama Liu ve arkadaşları tarafından, 2012 de tarif edilmiştir. 2 3. Bu teknik, ışınlanmış besleyici hücreler, ROCK önleyicisi ve koşullu yeniden programlama ortamı kullanılarak prostat ve meme kanseri biyopsilerinden elde edilen kanser epitelyal hücreleri genişletmek için kullanılmıştır. Hedefi, ilaç taraması gibi, in vitro tahliller için yeterli hücre elde etmek olmuştur. Bu teknik, yüksek proliferatif bir kök veya projenitör gibi devlet için "yeniden programlama", bu hücreler tarafından süresiz epitel hücreleri kadar esneme kabiliyetine sahiptir. Hücreler olmayan tümörijenik ve teratom 23, 24 oluşturmak için yeteneğine sahip olmadıklarını ortaya konmuştur. Bundan başka, herhangi birkromozomal anomali veya genetik manipülasyonlar bu tekniği 23, 24 kullanılarak kültürde bu hücrelerin Pasajlanması sonra hazır bulundu. En önemlisi, bu hücreler sadece ilgi yerli hücre tipine içine ayırt edebiliyoruz. Bu nedenle, bu teknik ölümsüzleşme gerek kalmadan hastalığı soruşturma ve doku mühendisliği için hastaya özgü epitel hücrelerinin büyük bir hazne bulunmaktadır.
hastalık süreçlerini araştırmak için özel bir organdan epitel dokusu elde nedeniyle hasta riskten kaynaklanabilecek olası genellikle sınırlı değil her zaman. özofagus hastalığı veya kusurları muzdarip hastalar için, endoskopik biyopsi alma ayrışmış ve şartlı o hastanın yemek borusu mukozasında özgü belirsiz bir hücre kaynağı sağlamak için yeniden olabilir epitel doku elde etmek için minimal invaziv bir yaklaşımdır. Bu, daha sonra, in vitro çalışmalar için izin verirepitel hücrelerinin potansiyel tedavi için hastalık süreçlerini ve ekrana değerlendirmek. Büyük ölçüde bu yaklaşımdan fayda olabilir Bir hastalık süreci yemek borusu 8 alerjik hastalık olarak tarif edilmiştir Eozinofilik Özofajit vardır. Alerji testleri yanı sıra tedavi yaklaşımları hastanın kendi epitel hücreleri kullanılarak in vitro değerlendirilebilir ve bu veriler daha sonra bireyselleştirilmiş tedavi planı geliştirmek için tedavi eden hekimin üzerine geçirilebilir. pediatrik hastalarda gelen endoskopik biyopsilerin ile birlikte koşullu yeniden programlama tekniği herhangi hastadan süresiz normal yemek borusu epitel hücreleri genişletmek için yeteneği sunar. Bu hücre kaynağı, bu nedenle kusur, hastalık ya da travma nedeniyle bir hastaya özgü cerrahi seçenek sunmakta doğal veya sentetik iskele ile birlikte takım olabilir. belirsiz hücre sayısına sahip olan tamamen reseeded sahip özofagus yapıları mühendisi yardımcı olacaksırayla özofagus epitel hücreleri ile lümen kalan hücre tipleri yenilenmesini kolaylaştırmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
bilgilendirilmiş onam pediatrik hastaların anne / veliler ve kurumsal inceleme kurulu (KİK # 13-094) ile uygun olarak elde edildikten sonra Özofagus biyopsiler alındı.
1. Sterilizasyon Cihazları ve Jelatin Çözümü
- Otoklav forseps, tıraş bıçakları ve kirlenmeyi önlemek için doku taşıma öncesinde makas.
- % 0.1 jelatin çözeltisi, 200 ml yapmak için, jelatin, 0.2 g damıtılmış su, 200 mL birleştirir. Otoklav ve serin, kullanımdan önce.
2. Kaplama doku kültürü plakaları
- önce hücre izolasyonu yaklaşık 2 saat, bir doku kültürü çanağı (100 mm) kapak ve bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe kadar% 0.1 jelatin ekleyin.
NOT: Bu plakalar aynı zamanda önceden yapılmıştır ve kullanım öncesi inkübatör tutulabilir.
3. Ayrışma Enzim Çözüm yapma
- Yaklaşık hücre izolasyonu öncesinde 30 dakika dışarı tartmakşişesindeki miligram konsantrasyonu başına birimlere dayalı bir denge üzerine dispase 10 birim. 37 ° C su banyosu içinde, 10 ml Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ve yer ile 15 ml konik bir tüp içinde bir toz yerleştirin.
4. yapma Hücre Kültürü Orta
- F12, 35 mL (Ham orta), DMEM 11.5 mL, L-glutamin, 0.5 mi, 100x penisilin / streptomisin, 0.5 mL, 2.5 mL: steril bir konik tüp içine, aşağıdaki terkip maddelerini karıştırın, koşullu yeniden programlama ortamı 50 ml yapmak için fetal sığır serumu (FBS), insan insülin, 250 ug, insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 500 ng.
- 3T3 ortamı 500 mL olmak FBS, 50 mL, 100 x penisilin / streptomisin ile 5 mL DMEM 500 mL L-glutamin, 5 ml karıştırın.
- keratinosit serumsuz ortamda 500 ml yapmak için, EGF ve (ortam ile sağlanır), sığır hipofiz özütü (BPB) takviyesi eritin. taban ortamının 500 ml şişeye takviyeleri ekleyin ve 10 5 mL0 x penisilin / streptomisin
bir besleme kaynağı 5. Kültüre ve ışınlanması 3T3 hücreleri,
- DMEM,% 10 FBS, 1 x penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin ihtiva eden 3T3 orta hazırlayın.
- Kültür, en az 3 gün hasta numunelerinin gelmesinden önce doku tedavi, T-75 şişelerinde 3T3 hücreleri.
- 5 mL'lik bir şişeye% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak 3T3 hücreleri, 5 dakika boyunca ya da pek çok hücre kadar 37 ° C'de inkübe hasta numunelerinin varış trypsinize hemen önce yüzer
- Reaksiyonu durdurmak için 3T3 ortamın 5 mL ekleyin. hücre süspansiyonu aspire ve 15 ml konik tüp transfer. 300 x g, 5 dakika boyunca spin.
- orta aspire ve hücre sayımı için tripan mavisi belirli bir hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri. ölü hücreleri hariç Tripan mavi 10 uL hücrelerin 10 uL birleştirin. hücre sayımı için bir hemasitometre Bu çözümün yük 10 mcL.
NOT: Bu proto içincol, ışınlanmış 3T3 hücreleri için ekim yoğunluğu 100 mm plaka başına 600.000 hücrelere eşit cm2 başına 10.900 hücredir. - 50 ml konik bir tüp içinde 3T3 ortamı 25 mL hasta numunesi ve tekrar süspansiyon başına 100 mm plaka plaka 3000 rad ile ışına maruz bırakmak için gerekli olan hücre sayısını kısım.
- Aşağıdaki ışınlama, aşağı 100 mm plaka başına 5 ml koşullu yeniden programlama ortamında 5 300 xg'de dk ve tekrar süspansiyon spin hücreleri.
- Hasta hücrelerin kaplama protokolünde sonra gerçekleşir kadar borunun yanına (adım 7.6 bakınız).
6. Pediatrik Özofagus Biyopsisi korunması ve taşınması, alınması
- 15 ml konik tüpe 100 ug / mL primocin tam keratinosit serumsuz ortamın 5 ml ilave edilir ve buz üzerinde tıbbi tesise getirin.
Not: ortamın Bu tüpler kadar 2 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir. - Ti yaklaşık 8 özofagus biyopsi eldeBana şöyle endoskopi ve ayrı:
- ıslak buz üzerinde 100 mg / ml primocin ve yeri ile komple keratinosit serum serbest orta içeren 15 ml konik altı biyopsi yerleştirin.
- ıslak buz üzerinde tamponlu formalin ve yer 5 mL biyopsi yerleştirin.
- uygun kesme ısısı bileşiği ile cryomold küçük biyopsisinde biyopsi yerleştirin.
- Hemen sıvı azot içinde yerleştirilmiş izopentan, bir cam kaba bu kalıba bırakın. Bir kez donmuş, bir numune torbasına cryomold koyun ve bir polistren köpük kap içinde kuru buz üzerinde saklayın.
- Bir yapışmalı torba içinde ve daha sonra ıslak buz içeren bir kargo kutusu içine orta veya formalin biyopsiye içeren tüpler yerleştirin. Mühür ve biyolojik tehlikeli etiketi kutuyu etiket ve laboratuvara taşıyın.
NOT: kuru buz içeren konteyner ve dondurulmuş biyopsi de mühürlü ve biyolojik tehlikeli etiketi ile işaretlenmiştir.
7. İşlemeMansap Kültür ve Analiz Hasta Doku
- Laboratuvarda varışta, aşağı kesit veya RNA ekstraksiyonu için ° C derin dondurucuda -80 kuru buz üzerinde donmuş biyopsi aktarın. formalin örnek yerleştirin. 4 ° C buzdolabında saklayın ve bir gecede düzeltmek için izin verir.
- 300 xg'de kalan biyopsi aşağı Spin ve orta aspire. konik tüp, contaya dispaz çözeltisi 10 ml ilave edilir ve 15 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- inkübasyonu takiben, 300 x g biyopsi aşağı doğru döndürün. % 0.05 tripsin-EDTA, 5 mL, orta ve tekrar süspansiyon biyopsi aspire.
- 100 mm steril plakaya biyopsileri içeren tripsin-EDTA 5 ml aktarın ve 2 sterilize Jilet mümkün olduğunca ince kullanarak biyopsi kıyma.
- yeni bir 15 ml konik kıyılmış biyopsi içeren tripsin-EDTA 5 ml aktarın. % 0.05 tripsin-EDTA ilave bir 5 mL 'si ile iki kez plaka yıkayın ve konik ekletüp. 37 ° C su banyosu içinde 10 dakika için tüp inkübe edin.
- inkübasyonu takiben, 5 dakika boyunca 300 xg (1.4 RPM) de biyopsi aşağı spin ve orta aspire. konik tüp gibi ışınlanmış besleyici hücreleri ihtiva eden şartlı yeniden programlama ortamı 5 mL koşullu yeniden programlama ortamı 5 mL (adım 5.7).
- doku kültürü çanağı jelatinin aspire sonra hücre süspansiyonu ve plakanın 10 mL ROCK inhibitörü (1 ul / ml) eklenir. 37 ° C'de inkübe edin.
8. Kültüre ve Yaygınlaştırılması Hücreler
- kültür yaklaşık 5 gün sonra, kıyılmış biyopsi parçaları içeren ilk orta aspire ve 5 ml steril PBS ile çanak 2-3 kez yıkayın. 10 uM'de ROCK inhibitörü içeren plakaya yeni orta ekleyin.
- % 70 confluency ulaştıktan sonra, hücre genişletin. levhaya% 0.05 tripsin-EDTA, 5 ml ilave edin ve 37 ° C inkübatör th çıkarmak için en fazla 2.5 dakika kuluçkalayıne besleme hücreleri. Bu inkübasyonun ardından, tripsin-EDTA aspirat ve 5 ml PBS ile plaka yıkayın.
- PBS aspire ve plaka% 0.25 tripsin-EDTA 5 ml ilave edilir ve 5-10 dakika için ya da hücrelerin plakasından gevşeyene kadar inkübe edilir. Reaksiyonu durdurmak ve 50 ml konik tüp sıvı nakledebilir ve 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürülür ve plakaya ortamın eşit miktarda ekleyin.
- Koşullu yeniden programlama ortamı belirli bir hacimde yeniden süspanse hücreleri ve tripan mavisi 10 uL süspansiyonu 10 uL karıştırın. toplam hücre sayısını belirlemek için bir hemasitometre güvenin.
- Hücreleri genişletme 1.200.000, 15 mL bir toplam hacimde 3T3 hücreleri, ışınlanmış ile 150 mm plaka 1.000.000, insan yemek borusu hücreleri ekleyin. 10 um taze ROCK inhibitörü ekleyin ve bir jelatin kaplı 150 mm çanak hücre süspansiyonu ekleyin.
9. Freeze ve Mağaza İnsan Özofagus Hücrelerine
- orta dondurma yapmak için,% 10 ilaveKoşullu yeniden programlama ortamı DMSO. tripsinize ve sayma sonra, yeni bir 50 ml konik tüp içine dondurmak ve 5 dakika boyunca 300 xg'de aşağı spin hücreleri bölmeyin.
- orta aspire ve cryovial başına 2 mL'lik bir hacimde orta dondurma ekleyin. Hücre süspansiyonu, homojen olduğunda, önceden etiketlenmiş cyrovials 10 6 hücre kısım. Uzun süreli sıvı azot depolama şişeleri hareket önce en az 24 saat boyunca -80 ° C'de bir dondurucu bir kap içine koyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hasta biyopsilerinden özofagus epitel hücreleri izole kilit adımların bir özeti Şekil 1'de özetlenmiştir. Epitel hücrelerinin kolonileri yaklaşık 4-5 gün içinde oluşturacak ve fibroblast besleyici hücreler (Şekil 2A) çevrili olacak. Bu koloniler genişletmek olarak daha büyük koloniler (Şekil 2B) oluşturmak için diğer koloniler ile birleştirilecek. Kültürler% 70 konfluent hale sonra, (Şekil 2C) genişletilmesi gerekmektedir. Fibroblastlar öncesinde epitel hücrelerin giderilmesine levhadan kaldırılır sağlamak için,% 0.05 tripsin-EDTA besleyiciler çıkarmak için 2.5 dakika için kullanılır. Besleyiciler yokluğu 2D Şekil benzer görünmelidir. Yapışkan epitel hücreleri daha sonra% 0.25 tripsin-EDTA ile tripsinize edildi ve yeni bir ışınlanmış besleyici hücreler (Şekil 2E) üzerine kaplandı edilir.
(Şekil 3A, daha fazla farklılaştırılmış epitelial hücre progenitör hücre fenotipinde bir değişiklik gösteren artar ). Bu hücreler, aynı zamanda akış sitometrisi ile epitelyal belirteçler için geçit 1 de analiz edilmiş ve üç hastadan, bu hücrelerin% 90 daha EpCAM (Şekil 3B) için pozitif idi. Hücreler aynı zamanda geçitler 1 ve 3 immünfloresan yoluyla analiz edildi Bu 3 pasajlar üzerinde fenotip değişen değildi sağlamak. Boyama epitel markör E-kadherin kalıcılığını göstermektedir (Şekil 4A-D), progenitör markör P63 (Şekil 4E-H), proliferasyon markör KI-67 (Şekil 4I-L) ve epitel sıkı birleşme kısmı proteini TJP1 (Şekil 4M-P ).
Son olarak, bir büyüme eğrisi koşullu yeniden programlama kültürde bu hücrelerin iki katına çıkma süresi değerlendirmek olmayan hastalıklı hastadan bir hücre çizgisi kullanılarak çizilmiştir. Hücreler 0. günde 100.000 hücre ile kaplandı ve 4 gün (Şekil 5) sadece biraz 500.000'den fazla hücreler olarak tespit edildi. iki katına çıkma süresi yaklaşık 36-40 saat olarak hesaplanmıştır. Hastalıklı hücreler, ancak her hasta bireysel farklılıkları hesaba ayrı ayrı değerlendirilmesi gerektiğini, daha yavaş bir katlama zaman var olması beklenmektedir.
1 ">
Şekil 1: Pediatrik Biyopsilerinde gelen İzolasyonu ve Kültürleme İnsan Özofagus Epitel Hücreleri bakış. Biyopsiler, bilgi verildikten sonra pediatrik hastalarda elde edilen ve laboratuara keratinosit serumsuz ortam içinde taşınmaktadır. Biyopsiler, daha sonra steril jilet doku kıyma ve son olarak% 0.05 tripsin-EDTA ile işleme tabi tutulur, dispase 1 U / mL ile muamele edilir. Hücre süspansiyonu daha sonra koşullu yeniden programlama ortamı içinde ışınlanmış besleyici hücreler eklenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kültürleme ve İnsan Özofagus Epitel Hücreleri genişletilmesi. Koşullu reprogram 5 gün sonra,ming ortamı, özofagus epitel hücreleri sonunda büyük koloniler (B) oluşturmak için yakınsama küçük parke taşı koloniler (A) oluşmaya başlar. Bir doku kültürü kabı (C),% 70 izdiham ulaştığında, levha de epitel hücreleri (D) bağlı kalırken, besleyici hücreleri çıkarmak için% 0.05 tripsin-EDTA ile çok kısa bir süre için tedavi edilir. epitel hücreleri daha sonra% 0.25 tripsin-EDTA ile çıkarıldı ve yeni bir besleyici hücreleri ile kaplandı edilir. Bu hücrelerin yeni koloniler oluştururlar ve çoğalmaya devam edecektir (E) ayrıldıktan sonra sadece 24 saat. Büyütme 100X olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Sitometrisi ve QRT-PKültür Genişletilmiş Hücrelerin CR Analizi. (A), koşullu yeniden programlama geçişine 1 kültürde hücrelerin Örnek gen p63 ekspresyonunun bir 6 kat artış, progenitör hücrelerin bir markörü olarak biyopsi gen ekspresyonu ile karşılaştırıldığında epitelyal belirteçler CDH1 ve TJP1 bir azalma göstermiştir. Bu hücre popülasyonu daha progenitör benzer bir hal ile ve bu nedenle daha yüksek proliferatif olduğunu gösterir. (Besleyici hücreler ve Kaya inhibitörü çıkarılmasından sonra) gen ifadesi 24 saat sonra yeniden programlama CDH1 ve TJP1 ifade ancak p63 ekspresyonunun bir azalma artış gösterir. (B) geçit 1 elde çeşitli hastalardan alınan hücrelerin Flow sitometri analizi EpCAM ifade eden hücrelerin daha büyük% 90 göstermektedir. Hastalar 26 ve 28 EÖ hasta hücreleri ise hasta 27 non-EÖ hasta hücreleri temsil eder. T tıklayınızo bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntüleyin.
Şekil 4: ışınlanmış besleyici hücreler koşullu yeniden programlama ortamı içinde yetiştirilen Pasajlar 1 hücre ve 3. Hücreleri immünofloresan boyama ekspres E-kadherin (A - B) ve progenitör markör P63 (E - H). Bu hücreler hala geçit 3 (- L I) de proliferatif bulunmaktadır. Son olarak, bu hücreler aynı zamanda, bir epitelyal fenotip (P - M) ile tutarlıdır sıkı birleşme kısmı proteini 1 (TJP1) ifade eder. Çekirdekler DAPI (mavi) ile zıt ve antikorlar bir Alexa Fluor 546 Antikor (Turuncu) kullanılarak tespit edilir. 2. Antikor (Ab) kontrol dokusu (S, R) sekonder antikor spesifik olmayan temsil eder. Ölçek çubukları = 50um. Büyütme 200X olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Şartlı yeniden programlanması Hücrelerin Büyüme Eğrisi. olmayan hastalıklı hastadan koşullu yeniden programlama ortamı içinde hücreler, tanımlanmış bir yoğunlukta tohumlandı ve üç adet 4 gün boyunca her gün sayıldı ve replike edildi. büyüme eğrisi yaklaşık Gün 4 ve Gün 0. bu hücrelerin iki katına çıkma süresi elde numaraları dayalı hesaplanan 36-40 saat zaman almaktadır, bu hücre sayıları kullanarak ve katlama oluşturulmuştur. Hata çubukları standart hata gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hasta biyopsilerinden özofagus epitel hücreleri izole ve genişletmek için en önemli adımlar şunlardır: 1) yeterli minimal hücre ölümü ile biyopsi doku dissociating; 2) temin ROCK önleyicisi, her bir değiştirilen ortam hücre kültürü ortamına ilave edilir; 3) önerilenden daha fazla besleyici hücreler kullanmayın; 4) Temiz aseptik kültürünü korumak; ve 5) izdiham ulaşmadan hemen önce geçiş hücreleri.
Nedeniyle şartlı yeniden programlama için elde edilen biyopsi örneklerinde hastaya bağlı farklılıklar nedeniyle, büyüme kinetikleri, fenotip ve çoklu geçitlere genişletmek için yeteneği farklılıkları beklemek mantıklıdır. Tipik haliyle, 4 özofagus biyopsi, hücre izolasyonu için her hastadan elde edilir. Bir kez ayrışmış, biz bu ortalama geçişi 3 ile 10 milyon hücre genişler 0. günde yaklaşık 300,000-600,000 hücreleri net. epitel hücre hatları için açıklanan arnavut kaldırımlı morfolojisi benzer görünmelidir oluşturan kolonilerin morfolojisi <sup class = "xref"> 25 (Şekil 2). Kültürdeki hücrelerin bir örneği akış sitometrisi ve epitel belirteçler için immünofloresan genişletme popülasyonu kökenli gerçekten de epitel (Şekil 3) sağlamak için, qRT-PCR yoluyla analiz edilmelidir. Hücreler epitel belirteçleri (E-Cadherin, EpCAM, TJP1) ifade gerekmiyor, hücre hattı iptal ve atılmalıdır. Menşe epitel ise söz hücrelerin% 90 daha EpCAM pozitif olduğu tahmin edilmektedir. kültürler fenotip değiştirme veya epitel ifade, immünofloresan kaybediyor olmadığını değerlendirmek veya sitometri epitel belirteçleri (E-kaderin), progenitör anlatım (P63) ve epitel sıkı kavşak proteinler (TJP1) değerlendirmek için kullanılmalıdır akış için. Hücreler fenotipik değiştirmemelidir beklenmektedir geçişli olarak, proliferasyon düşmez ve bu hücreler, epitelyal ifade hem de progenitör ekspresyonu (Şekil 4 göstermelidir (Şekil 5) bir nüfus iki katına zaman var gibi görünüyor. fazla 5 gün boyunca iki katına değil bulunan hücreler yaşlanmış olması muhtemeldir ve atılmalıdır.
Böyle EÖ olarak mevcut inflamatuar süreçlere olan hastalarda izole edilen hücreler, azalan bir çoğalma oranı epitel hücreleri sahip olduğu tarif edilmiştir (Şekil 3, 26 ve 28 hasta) ve apoptoz 26 yüksek oranda E-kadherin ifade azalmıştır. Nedenle, bu yöntemi kullanarak bir ağır hasta hastadan zorluk kültürleme hücreleri olması mantıksız değil. Hücreler sadece birkaç pasajlar hatta sadece ilk geçişini dayanacak olasıdır. Bu hala orijinal olarak izole edilmiş çok hücre daha fazla sayıda araştırmacı sağlamalıdır. Ancak, bu sayı yeterli olmayabilirÖnerilen tüm çalışmalar için. Bu hücreler sonuçta özofagus hastalığı incelemek veya özofagus replasmanı oluşturmak için kullanılan olduğundan, hücrelerin mukozal rejenerasyonu için sadece sorumlu hatırlamak önemlidir. fibroblastlar, nöronlar, düz kas hücreleri ve kan damarları gibi diğer hücre tipleri de özofagus hastalığının çalışmaya ve doku mühendisliği uygulamaları için sadece kadar önemlidir.
Bu teknik hastalık patogenezi okuyan yanı sıra özofagus doku mühendisliği uygulamaları için hasta özgü hücrelerin potansiyel rezervuar olarak hizmet için paha biçilmez bir araçtır bir hastaya özgü hücre kaynağı sunmaktadır. cerrahi implantasyon için biyo materyaller tohumlama için kullanılan hücreler, genetik anormalliklerin, viral sekansların serbest ve teratom formunda olmamalıdır. Kök hücrelerin (Multipotent veya pluripotent) kullanımı da ayırıcı tabi olmasaydı hangi bazı teratom oluşturabilir, farklılaşma aşağıdaki çok istenmeyen hücre tipleri üretirsokan. Ayrıca, bu hücre kaynağı fenotipi tutarlı ve saflaştırılması veya istenmeyen hücre kaldırılmasını gerektirmez. İdeal hücre kaynağı mühendislik ediliyor aynı anatomik konumda bulunan hücreler olacaktır. Bu yaklaşımda bu özofagus epitel hücreleri bir özofagus iskele mukozayı yeniden doldurmak için kullanılmaktadır. Ek hücre tipleri özofagus rejenerasyon için gerekli olan; Bu sızıntı, darlık ve perforasyona yol açabilir olarak ancak bu tekniğin odak eksik değil mukoza reseeded edildi sağlamak ve.
yemek borusu yeni cerrahi seçenekler mühendislik bu hücreleri kullanılarak, ek olarak, bu hücreler aynı zamanda bu durumları tedavi etmek için yeni terapötik yaklaşımlar için özofagus hastalık süreçlerini de ekran çalışma için kullanılabilir. Eozinofilik özofajit (EÖ) henüz tam olarak tarif tam mekanizması ve patogenezi ile özofagus bir alerjik hastalık olarak tanımlanmaktadır. Güncel tedavi regiments eliminasyon diyetleri, oral steroid ve çoklu endoskopi bulunmaktadır. Hiçbir tahlil, bir "tahmin ve kontrol" kullanımı uzun ve hasta için çoğu zaman sinir bozucu olan yaklaşımı doktorların yol her hasta için inflamatuar süreci tetikler değerlendirmek için vardır. hastaya özgü hücre genişlemesinin, bu yöntem, lentiviral transdüksiyon veya genetik modifikasyon kullanmaz için, yeniden programlama işlemi hücrelerin genotipine kalıcı değişiklikler ihtimali çok azdır. Bu hücreler, teorik olarak, in vivo ortamda farklı değildir anlamına gelir. In vitro olarak, hasta hücreler test etme yeteneği tetikleyici madde yeni kabul edilebilir tespit etmek ve sonuç olarak, bu pediyatrik hastalar için yeni teşhis ve terapötik gelişmesine neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
