Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murin modell av Fulminant myokarditt ved lysarkmikroskopi
Summary
Her beskriver vi en mikroskopi for lette ark for å visualisere den kardiale CD45 + leukocyttinfiltraten i en murin modell av aseptisk fulminant myokarditt, som er indusert av intratracheal difteritoksinbehandling av CD11c.DTR-mus.
Abstract
Lysveisfluorescensmikroskopi (LSFM), i kombinasjon med kjemiske clearingprotokoller, er blitt gullstandarden for analyse av fluorescensmerkede strukturer i store biologiske prøver, og er ned til cellulær oppløsning. I mellomtiden gjør den konstante forfiningen av underliggende protokoller og økt tilgjengelighet av spesialiserte kommersielle systemer oss til å undersøke mikrostrukturen til hele musorganene og tillate selv karakterisering av cellulær oppførsel i ulike levende cellebilder. Her beskriver vi en protokoll for romlig helmontert visualisering og kvantifisering av CD45 + leukocyttpopulasjonen i inflammerte mushjerter. Metoden anvender en transgen musestamme (CD11c.DTR) som nylig har vist seg å fungere som en robust, induktiv modell for studiet av utviklingen av fulminant dødelig hjerteinfarkt, karakterisert ved dødelig hjertearytmi. Denne protokollen inkluderer myokardittinduksjon, intravitAl antistoff-mediert cellefarging, organpreparasjon og LSFM med etterfølgende datastøttet bilde etterbehandling. Selv om den presenteres som en svært tilpasset metode for vårt spesifikke vitenskapelige spørsmål, representerer protokollen utskrift av et lettjusterbart system som også kan målrette helt forskjellige fluorescerende strukturer i andre organer og til og med i andre arter.
Introduction
Under utviklingen av lysmikroskopi oppstod mange spesialiserte former, alle utviklet for å minimere begrensninger i visualiseringsprosessen for bestemte prøver. En slik metode er fluorescensmikroskopi (LSFM) med lysark. Først utviklet i 1903 av Siedentopf og Zsigmondy 1 og funnet sine første grunnleggende biologiske anvendelser tidlig på 1990-tallet 2 , har LSFM blitt det mest kraftfulle mikroskopiske verktøyet til dags for visualisering av store prøver, som intakte musorgrupper, med en fluorescenssignaloppløsning Ned til mobilnettet. På grunn av disse fordelene, i kombinasjon med potensialet for live-celledannelse, heter Nature Methods LSFM "Årets metode 2014 3. "
Som navnet antyder, blir prøvebelysningen i en LSFM utført av lette ark, som er orientert vinkelrett på aksen til objektet som brukes fEller utslipp-lys samling og etterfølgende bildedannelse. Lysarket genereres vanligvis enten ved å fokusere brede, kollimerte laserstråler med en sylindrisk linse eller ved rask sidelengs bevegelse av smale, fokuserte laserstråler i bare ett horisontalt eller vertikalt plan 4 , 5 . På denne måten lyser kun fotografisk optikkens fokalplan, typisk med en tykkelse på 1-4 μm. Følgelig, for en fluorescerende prøve plassert i belysningsplanet, elimineres både genereringen av spredt lys og virkningene av fotoblekking fra regioner over eller under fokusplanet eller undertrykkes kraftig 6 , 7 . Ettersom alle out-of-focus-planene ikke er opplyst, utelates fotoblekkseffekter i disse områdene. I motsetning til standard konfokal- eller multi-fotonmikroskopi er stiene til opplyst og utstrålt lys skilt fra hverandre, slik at den endelige bildekvaliteten Ity er ikke avhengig av perfekt fokusering av eksitasjonslysstrålen gjennom målene. Avhengig av det underliggende spørsmålet, er det derfor mulig å bruke mål med et enormt synsfelt (FOV) slik at det største mulige arealet i det opplyste planet kan avbildes uten at noen komponentdeler beveger seg i xy-retningen.
I moderne LSFM-systemer blir et fluorescerende bilde av den genererte optiske delen tatt på en svært følsom ladetilkoblet enhet (CCD) eller komplementære metalloksidhalvlederkameraer, som er i stand til å erverve hele synsfeltet (FOV) I mikrosekunder. Ved å flytte prøven gjennom lysplaten og ved å anskaffe bilder ved definerte z-trinn, er det derfor mulig å oppnå full 3D-informasjon av en prøve i en rimelig tidsperiode 8 , 9 , noe som gjør denne teknikken anvendelig for levende celle Studier 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Likevel, selv om LSFM tilbyr en rask, sensitiv og fluorescens-vennlig metode, er lysoverføring gjennom prøven fortsatt et stort problem, spesielt når store biologiske prøver er målet for en 3D-analyse. Lystransmisjon er kritisk modifisert av fysiske aspekter ved absorpsjon og ved lysspredning ved grensesnitt av strukturer med forskjellige brytningsindekser 13 . Derfor, når bildebehandlingen prøver flere millimeter i størrelse, er LSFM for det meste kombinert med clearingprotokoller for å gjøre prøvene optisk gjennomsiktige. Disse teknikkene er basert på ideen om å fjerne vann fra det respektive biologiske vev og utveksle det med vann- eller (organisk) løsningsmiddelbasert nedsenkningsmedium, som er valgt for å begrense brytningsindeksene til de spesifikke målvevskomponentene. Som et resultat minimeres sidestrålespredning, og alle bølgelengderAv lys kan mye mer effektivt passere gjennom vevet 13 . I mange tilfeller ser biologiske prøver som er behandlet på denne måten ut makroskopisk krystallklar, noe som gjør at LSFM kan utføres, selv på hele musorgruppene, ved hjelp av lange arbeidsavstand, lave forstørrelsesmål.
Her presenterer vi en forberedelsesprotokoll for storprøvebilder i et lysarkmikroskop (se tabell over materialer), som vi har etablert for å undersøke det cellulære hjerteinfiltratet i en murin modell av myokarditt 15 . CD11c.DTR-mus uttrykker primat difteri-toksinreseptoren (DTR) under kontroll av CD11c-promotoren 16 . Følgelig blir celler i disse musene, som uttrykker CD11c sammen med DTR, gjort følsomme overfor exotoxinet av Corynebacterium difteri (difteritoksin, DTX); Den systemiske behandlingen av disse dyrene med DTX resulterer i en utarming av alle CD11c + cells. CD11c er et integrin og, som en celleoverflaterreseptor for en rekke forskjellige oppløselige faktorer, er involvert i aktiverings- og modningsprosesser hovedsakelig i celler av den monocytiske linjen 17 . Følgelig har CD11c.DTR-musemodellen vært intensivt brukt til å studere rollen av dendritiske celler og makrofagundergrupper i sammenheng med mange forskjellige immunologiske spørsmål. Over tid har det blitt rapportert at CD11c.DTR-mus behandlet systemisk med DTX kan utvikle uønskede bivirkninger og kan vise sterkt forhøyede dødelighetsgrader 18 , 19 . Nylig var vi i stand til å identifisere den underliggende dødsårsaken 15 , som beskriver utviklingen av fulminant myokarditt etter intratracheal DTX-applikasjon i disse dyrene. Toksinutfordringen forårsaket cellulær ødeleggelse, inkludert i sentrale deler av stimulusoverføringssystemet i hjertet. Dette ble ledsaget av massiv CD45+ Leukocytt infiltrere, som til slutt fører til dødelig hjertearytmi. I dette tilfellet var ikke bare forekomsten av leukocyttpopulasjonen viktig, men også dens romlige fordeling inne i hjertet. Dette eksperimentelle spørsmålet er en utfordring for moderne mikroskopisk avbildning, som vi har løst ved hjelp av en mikroskopisk tilnærming til lysark som støttes av intravital antistofffarging og en organisk løsningsmiddelbasert optisk rydningsprotokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
I moderne livsvitenskap spiller den mikroskopiske visualiseringen av biologiske prosesser en stadig viktigere rolle. I denne sammenheng har mange utviklinger blitt oppnådd de siste to århundrene som bidrar til å svare på spørsmål som ikke kan adresseres til dette punktet. For det første har det vært en klar tendens til å fundamentalt øke oppløsningsevnen til lysmikroskop. Med strukturert belysningsmikroskopi (SIM) 21 , 22 , stimulert utslippsdepletjon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Gunzer-laboratoriet ble støttet av det tyske forbundsdepartementet for utdanning og forskning (stipend nr. 0315590 AD) og av tysk forskningsfond (stipend nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Vi takker også IMCES for teknisk støtte og Sebastian Kubat for hjelp med 3D tegneserie modellering.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
Riferimenti
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
