光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化
Summary
ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。
Abstract
Light-sheet fluorescence microscopy（LSFM）は、化学的クリアリングプロトコールと組み合わせて、大きな生物学的試料中の蛍光標識された構造を分析するためのゴールドスタンダードとなっており、細胞分解能に達しています。その一方で、基礎となるプロトコルの絶え間ない改良と特殊な商用システムの利用性の向上により、マウスの器官全体の微細構造を調べることができ、様々な生存細胞イメージングアプローチにおける細胞の挙動の特徴づけまで可能にしました。ここでは、炎症を起こしたマウスの心臓におけるCD45 +白血球集団の空間的全マウント視覚化および定量化のためのプロトコルを説明する。この方法は、致命的な心臓不整脈を特徴とする致命的な致死性心筋炎の発達の研究のための頑強な誘導性モデルとして機能することが最近示されているトランスジェニックマウス株（CD11c.DTR）を使用する。このプロトコルには、心筋炎の誘導、腹腔内アル抗体媒介性細胞染色、器官調製、およびその後のコンピュータ支援画像後処理を伴うLSFMを含む。我々の特定の科学的な問題に高度に適合した方法として提示されているが、プロトコールは、他の臓器および他の種においても全く異なる蛍光構造を標的とすることができる容易に調節可能なシステムの青写真を表す。
Introduction
光学顕微鏡の進化の間、多くの特殊な形態が現れ、それらの全てが特定の標本の視覚化プロセスの限界を最小限に抑えるために開発された。このような方法の1つは、薄シート蛍光顕微鏡法（LSFM）である。最初にSiedentopfとZsigmondy 1によって1903年に開発され、1990年代初頭の最初の基本的な生物学的応用を発見した2。LSFMは、蛍光シグナルの分解能を持つ無傷のマウス器官などの大きな標本の視覚化のための最も強力な顕微鏡ツール細胞レベルまで低下する。これらの利点のために、生存細胞イメージングの可能性と組み合わせて、Nature MethodsはLSFMを「2014年の方法」 3と名付けました。
名前が示唆するように、LSFMでのサンプル照明は、使用される対物レンズの軸に垂直に向けられた光シートによって行われますまたは発光光収集およびその後の画像形成を含む。光シートは、通常、シリンドリカルレンズを用いて広いコリメートされたレーザビームを集束することによって、またはただ1つの水平または垂直平面4,5 において狭く集束されたレーザビームの迅速な横方向移動によって生成される。このようにして、結像光学系の焦点面のみが、典型的には1~4μmの厚さで照明される。その結果、照明面に置かれた蛍光試料については、散乱光の生成と、焦点面の上方または下方の領域からの光退色の影響がともに排除または大幅に抑制される6,7 。すべての焦点外れ面が照らされないので、これらの領域では光退色効果は省略される。標準的な共焦点または多光子顕微鏡法とは対照的に、照射された光および放出された光の経路は互いに分離されているので、最終的な画像品質対物レンズを通る励起光ビームの完全な集束には依存しない。基礎となる質問に依存して、膨大な視界（FOV）を有する対物レンズを使用することが可能であり、照明された平面の可能な限り大きな領域を、xy方向に移動する構成部品なしで撮像することができる。
現代のLSFMシステムでは、生成された光学セクションの蛍光画像が、高感度の電荷結合素子（CCD）または相補型金属酸化膜半導体（CMOS）カメラ上に捕捉され、視野全体（FOV）マイクロ秒単位。したがって、光シートを通って試料を移動させ、規定されたzステップで画像を取得することによって、合理的な時間8,9 において試料の完全な3D情報を得ることができ、この技術を生細胞に適用することができる研究10 、ass = "xref"> 11,12。
それにもかかわらず、LSFMは迅速で、感度が高く、蛍光に優しい方法を提供するが、特に大きな生体試料が3D解析の標的である場合、標本を通る光の伝達は依然として大きな問題である。光の透過率は、吸収の物理的な側面と屈折率の異なる構造の界面での光の散乱によって決定的に変化します13 。したがって、数ミリメートルの大きさの試料を撮像する場合、LSFMは、大部分が透明化プロトコルと組み合わされて、試料を光学的に透明にする。これらの技術は、それぞれの生物学的組織から水分を除去し、特定の標的組織成分の屈折率に狭く一致するように選択された水または（有機）溶媒ベースの液浸媒体と交換するという考えに基づいている。その結果、横方向散乱が最小限に抑えられ、すべての波長より効率的に組織13を通過することができる。多くの場合、このように処理された生物学的標本はマクロ的に結晶透明であり、長い作動距離、低倍率の目的を用いてLSFMをマウスの器官全体でさえも導くことができる。
ここでは、心筋炎マウスモデルの細胞心臓浸潤を調べるために確立した薄いシート顕微鏡（材料の表を参照）での大量サンプルイメージングの準備プロトコールを示します。 CD11c.DTRマウスは、CD11cプロモーター16の制御下で霊長類ジフテリア毒素受容体（DTR）を発現する。その結果、DTRとともにCD11cを発現するこれらのマウスの細胞は、 Corynebacterium diphtheria （ジフテリア毒素、DTX）の外毒素に対して感受性になる 。これらの動物をDTXで全身治療すると、すべてのCD11c + ceが枯渇するlls。 CD11cはインテグリンであり、様々な異なる可溶性因子の細胞表面受容体として、主に単球系譜17の細胞において活性化および成熟プロセスに関与する。その結果、CD11c.DTRマウスモデルは、多くの異なる免疫学的質問の文脈における樹状細胞およびマクロファージサブセットの役割を研究するために集中的に使用されている。時間の経過とともに、DTXで全身治療されたCD11c.DTRマウスは有害な副作用を引き起こし、死亡率が著しく上昇することが報告されている18,19。最近、本発明者らは、これらの動物における気管内DTX適用後の劇症性心筋炎の発症を説明する、根本的な死因15を特定することができた。毒素攻撃は、心臓における刺激伝達系の中心部を含む細胞破壊を引き起こした。これには大量のCD45+白血球浸潤、最終的に致命的な心臓不整脈に至る。この場合、白血球集団の出現が重要であるだけでなく、心臓内部の空間分布も重要であった。この実験的問題は、現代の顕微鏡イメージングの課題であり、私たちは、生体内抗体染色および有機溶媒ベースの光学的クリアリングプロトコルによって支持される薄いシート顕微鏡法によって解決した。
Protocol
Representative Results
Discussion
現代の生命科学では、生物学的プロセスの顕微鏡視覚化がますます重要な役割を果たしている。この文脈では、この時点までに対処できない質問に答えるために役立つ過去2世紀の間に多くの開発が達成されました。第1に、光学顕微鏡の解像度能力を根本的に増加させる明らかな傾向があった。一度仮定された分解能制限による構造化照明顕微鏡（SIM） 21,22 、誘導?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gunzer研究所の研究は、ドイツ連邦教育研究省（付与番号0315590 AD）およびドイツ研究財団（付与番号GU769 / 4-1、GU769 / 4-2）の支援を受けていた。テクニカルサポートについてはIMCES、3D漫画モデリングについてはSebastian Kubatに感謝いたします。
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
Riferimenti
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
