ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור
Summary
כאן, אנו מתארים גישה מיקרוסקופית אור גיליון לדמיין את הלב CD45 + ליקוציט לחדור במודל Murine של שריר הלב, שריר הלב, אשר נגרמת על ידי טיפול דיפריה intraracheal intrachecheal של עכברים CD11c.DTR.
Abstract
מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי (LSFM), בשילוב עם פרוטוקולי ניקוי כימיים, הפך את תקן הזהב לניתוח מבנים שכותרתו fluorescently בדגימות ביולוגיות גדולות, והוא עד רזולוציה הסלולר. בינתיים, חידוד מתמיד של הפרוטוקולים הבסיסיים ואת הזמינות המשופרת של מערכות מסחריות מיוחדות מאפשרים לנו לחקור את המיקרו של איברים העכבר כולו ואף לאפשר את אפיון ההתנהגות הסלולרית גישות שונות לחיות הדמיה תא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול הדמיה מרחבית שלמה הר לכימות של האוכלוסייה +45 leukocyte CDI בלבבות עכברים מודלק. השיטה מעסיקה זן עכבר מהונדס (CD11c.DTR), אשר הוכח לאחרונה לשמש מודל חזק, inducible לחקר התפתחות של דלקת שריר הלב הקטינית, מתאבדת על ידי הפרעות בקצב הלב קטלני. פרוטוקול זה כולל אינדוקציה שריר הלב, intravitאל נוגדנים בתיווך מכתים התא, הכנה איברים, ו LSFM עם המחשב הבא בסיוע תמונה שלאחר עיבוד. למרות שהוצג כשיטה מתואמת מאוד עבור השאלה המדעית שלנו, הפרוטוקול מייצג את תכנית אב של מערכת מתכווננת בקלות שיכולה גם למקד מבנים ניאון שונים לחלוטין באיברים אחרים ואפילו מינים אחרים.
Introduction
במהלך האבולוציה של מיקרוסקופ אור, הופיעו צורות מיוחדות רבות, כולם פיתחו כדי למזער מגבלות בתהליך הדמיה עבור דגימות מסוימות. שיטה אחת כזו היא אור גיליון גיליון מיקרוסקופ פלואורסצנטי (LSFM). הראשון שפותח בשנת 1903 על ידי Siedentopf ו Zigigundy 1 ו מציאת יישומים ביולוגיים בסיסיים הראשון שלה בתחילת 1990 2 , LSFM הפך את כלי מיקרוסקופי חזק ביותר עד כה להדמיה של דגימות גדולות, כגון איברים עכבר שלם, עם רזולוציה האות פלואורסצנטי עד לרמה התאית. בגלל היתרונות הללו, בשילוב עם הפוטנציאל שלה לחיות תא הדמיה, שיטות טבע בשם LSFM "השיטה של השנה 2014 3 ".
כפי שהשם מרמז, תאורה המדגם LSFM מתבצע על ידי גיליונות אור, אשר מכווננים בניצב לציר של המטרה המשמש fאו אוסף אור פליטה ויצירת התמונה הבאים. גיליון האור נוצר בדרך כלל על ידי מיקוד קורות לייזר רחבות וקולימטיות עם עדשה גלילית או על ידי תנועה צדדית מהירה של קורות לייזר ממוקדות צרות במישור אופקי אחד או אנכי 4 , 5 . בדרך זו, רק את המטוס המוקד של אופטיקה הדמיה מואר, בדרך כלל עם עובי של 1-4 מיקרומטר. כתוצאה מכך, עבור מדגם פלואורסצנטי להציב את המטוס תאורה, הן את הדור של אור מפוזרים ואת ההשפעות של photobleaching מאזורים מעל או מתחת למישור המוקד מסולקות או מדוכא מאוד 6 , 7 . כמו כל המטוסים מחוץ להתמקד לא מואר, אפקטים photobleaching מושמטים באזורים אלה. בניגוד למיקרוסקופיה קונפוקלית או רב פוטון רגילה, נתיבי האור המואר והנפלט נפרדים זה מזה, כך שהדימוי הסופי של התמונה Ity אינו תלוי במיקוד המושלם של קרן אור עירור דרך מטרות. בהתאם לשאלה הבסיסית, זה אפשרי ולכן ניתן להשתמש ביעדים עם שדה עצום של נוף (FOV), כך השטח הגדול ביותר האפשרי של המטוס מואר ניתן הדמיה ללא כל רכיב חלקים נעים בכיוון xy.
במערכות LSFM מודרניות, תמונה פלואורסצנטית של החלק האופטי שנוצר נלכדת במצלמת מוליכים למחצה (CMOS) משוכללים (CCD), או במצלמות משלימות של מתכת, המספקות את כל שדה הראייה (FOV) ב microseconds. לכן, על ידי הזזת המדגם דרך הסדין האור על ידי רכישת תמונות ב z-שלבים מוגדרים, ניתן לקבל את המידע המלא 3D של דגימה בסכום סביר של זמן 8 , 9 , מה שהופך את הטכניקה הזו תקף עבור תא חי Pid 12 ,התחת = "xref"> 11 , 12 .
עם זאת, למרות LSFM מציעה שיטה מהירה, רגישה, ידידותית פלואורסצנטי, שידור אור דרך הדגימה היא עדיין בעיה גדולה, במיוחד כאשר דגימות ביולוגיות גדולות הן היעד לניתוח 3D. העברת האור משתנה באופן קריטי על ידי היבטים פיזיים של הקליטה ועל ידי פיזור האור על ממשקים של מבנים עם מדדי השבירה שונים 13 . לכן, כאשר דגימות הדמיה כמה מילימטרים בגודל, LSFM הוא בשילוב בעיקר עם פרוטוקולי ניקוי כדי להפוך את דגימות אופטיות שקוף. טכניקות אלה מבוססות על הרעיון של הסרת מים מהרקמה הביולוגית המתאימה והחלפתם עם חומרי טבילה מבוססי מים או אורגניים המבוססים על ממס, אשר נבחרים להתאים באופן צר את מדדי השבירה של מרכיבי רקמת היעד הספציפיים. כתוצאה מכך, פיזור אור לרוחב ממוזער, וכל אורכי גלשל האור יכול לעבור ביעילות רבה יותר דרך הרקמה 13 . במקרים רבים, דגימות ביולוגיות המטופלות בדרך זו מופיעות בצורה צלולה ומאקרוסקופית, המאפשרת LSFM להתנהל גם על איברים של עכבר שלם, תוך שימוש במרחקים ארוכים, מטרות הגדלה נמוכות.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הכנה עבור הדגימה מדגם גדול במיקרוסקופ אור (ראה טבלה של חומרים), אשר הקמנו לחקור את חדירת הלב הסלולר במודל Murine של שריר הלב 15 . עכברים CD11c.DTR לבטא את קולטן רעלן dymhtheria הפרימטים (DTR) תחת שליטה של promotor CD16c 16 . כתוצאה מכך, תאים בעכברים אלה, אשר מבטאים CD11c יחד עם DTR, רגישים אקזוטיים של Corynebacterium diphtheria (רעלן diphtheria, DTX); את הטיפול המערכתי של בעלי חיים אלה עם תוצאות DTX דלדול של כל CD11c + CELls. CD11c הוא אינטגרין, וכקולטן של תא-תאים למגוון גורמים מסיסים שונים, מעורב בתהליכי הפעלה והתבגרות בעיקר בתאי השושלת המונוציטית. כתוצאה מכך, מודל העכבר CD11c.DTR כבר בשימוש אינטנסיבי ללמוד את התפקיד של תאים דנדריטים ותת מקרופאגים בהקשר של שאלות חיסוניות רבות. עם הזמן, דווח כי עכברים CD11c.DTR מטופלים באופן שיטתי עם DTX יכול לפתח תופעות לוואי שליליות והוא יכול להציג שיעורי תמותה גבוהות מאוד 18 , 19 . לאחרונה, הצלחנו לזהות את הסיבה הבסיסית למוות 15 , המתאר את התפתחותה של שריר הלב הדוקרני לאחר יישום DTX תוך-עיני אצל בעלי חיים אלו. האתגר הרעלני גרם להרס תאי, כולל בחלקים מרכזיים של מערכת התמריצים בלב. זה היה מלווה מסיבי CD45+ ליקוציט לחדור, ולבסוף מוביל הפרעות קצב לב קטלניות. במקרה זה, לא רק הופעתו של אוכלוסיית לויקוציטים חשוב, אלא גם את החלוקה המרחבית שלה בתוך הלב. זו השאלה הניסויית היא אתגר עבור הדמיה מיקרוסקופית המודרנית, אשר יש לנו לפתור על ידי גישה מיקרוסקופית אור גיליון נתמך על ידי מכתים נוגדן intravital ו הממס אורגני מבוסס פרוטוקול ניקוי אופטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במדעי החיים המודרניים, הדמיון המיקרוסקופי של תהליכים ביולוגיים ממלא תפקיד חשוב יותר ויותר. בהקשר זה, התפתחויות רבות הושגו במהלך שתי המאות האחרונות המסייעות לענות על שאלות שאינן ניתנות להתייחסות עד לנקודה זו. ראשית, יש נטייה ברורה להגדיל באופן משמעותי את יכולת ההחלט?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר במעבדה Gunzer נתמך על ידי משרד החינוך הגרמני הפדרלי לחקר ומחקר (מס '0315590 AD) ועל ידי קרן המחקר הגרמנית (מענק מס' GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). אנו מודים עוד IMCES עבור תמיכה טכנית Sebastian Kubat לעזרה עם מודלים 3D Cartoon.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
Riferimenti
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
