Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera
Summary
En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 + cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.
Abstract
La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM), en combinación con los protocolos de eliminación química, se ha convertido en el estándar de oro para el análisis de estructuras marcadas con fluorescencia en muestras biológicas grandes, y es hasta la resolución celular. Mientras tanto, el refinamiento constante de los protocolos subyacentes y la mayor disponibilidad de sistemas comerciales especializados nos permiten investigar la microestructura de los órganos de ratones enteros e incluso permitir la caracterización del comportamiento celular en varios enfoques de imágenes de células vivas. Aquí, describimos un protocolo para la visualización y cuantificación de todo el espacio espacial de la población de leucocitos CD45 + en corazones de ratón inflamados. El método emplea una cepa de ratón transgénico (CD11c.DTR) que recientemente se ha mostrado que sirve como un modelo robusto e inducible para el estudio del desarrollo de la miocarditis fatal fulminante, caracterizada por arritmias cardíacas letales. Este protocolo incluye la inducción de miocarditis, intravitAl mediada por anticuerpos, preparación de órganos y LSFM con subsiguiente procesamiento de imágenes asistido por ordenador. Aunque presentado como un método altamente adaptado para nuestra particular cuestión científica, el protocolo representa el modelo de un sistema fácilmente ajustable que también puede dirigirse a estructuras fluorescentes completamente diferentes en otros órganos e incluso en otras especies.
Introduction
Durante la evolución de la microscopía óptica, aparecieron muchas formas especializadas, todas ellas desarrolladas para minimizar las limitaciones en el proceso de visualización de especímenes particulares. Uno de estos métodos es la microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM). Desarrollado en 1903 por Siedentopf y Zsigmondy 1 y encontrando sus primeras aplicaciones biológicas fundamentales a principios de la década de 1990 2 , LSFM se ha convertido en la herramienta microscópica más poderosa hasta la fecha para la visualización de especímenes grandes, como órganos de ratones intactos, con una resolución de señal de fluorescencia Hasta el nivel celular. Debido a estos beneficios, en combinación con su potencial de imágenes de células vivas, Nature Methods nombró a LSFM como el "Método del Año 2014 3 ".
Como su nombre sugiere, la iluminación de la muestra en un LSFM es conducida por hojas de luz, que están orientadas perpendicularmente al eje del objetivo utilizado fO la recolección de luz de emisión y posterior formación de imagen. La lámina de luz se genera generalmente centrando los rayos láser colimados anchos con una lente cilíndrica o por el movimiento lateral rápido de rayos láser estrechos enfocados en apenas un plano horizontal o vertical 4 , 5 . De esta forma, sólo se ilumina el plano focal de la óptica de formación de imágenes, típicamente con un espesor de 1-4 μm. Por consiguiente, para una muestra fluorescente colocada en el plano de iluminación, tanto la generación de luz dispersa como los efectos del fotoblanqueo desde regiones por encima o por debajo del plano focal se eliminan o se suprimen en gran medida 6 , 7 . Como todos los planos fuera de foco no se iluminan, los efectos de fotoblanqueo se omite en estas áreas. En contraste con la microscopía confocal o multi-fotónica estándar, los caminos de la luz iluminada y emitida están separados unos de otros, por lo que la imagen final qual No depende del enfoque perfecto del haz de luz de excitación a través de los objetivos. Dependiendo de la pregunta subyacente, es posible utilizar objetivos con un campo de visión enorme (FOV) de modo que la mayor área posible del plano iluminado pueda ser visualizada sin ninguna parte componente que se mueva en la dirección xy.
En los modernos sistemas LSFM, se capta una imagen fluorescente de la sección óptica generada en un dispositivo de carga acoplada altamente sensible (CCD) o cámaras de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS), que son capaces de adquirir todo el campo de visión (FOV) En microsegundos. Por lo tanto, moviendo la muestra a través de la lámina de luz y adquiriendo imágenes a pasos z definidos, es posible obtener la información 3D completa de una muestra en una cantidad de tiempo razonable 8 , 9 , haciendo esta técnica aplicable para células vivas Estudios 10 ,Asno = "xref"> 11 , 12 .
Sin embargo, aunque LSFM ofrece un método rápido, sensible y amigable a la fluorescencia, la transmisión de luz a través de la muestra sigue siendo un problema importante, especialmente cuando las grandes muestras biológicas son el blanco para un análisis 3D. La transmisión de la luz se modifica críticamente por los aspectos físicos de la absorción y por la dispersión de la luz en las interfaces de las estructuras con diferentes índices de refracción [ 13] . Por lo tanto, cuando las muestras de imagen de varios milímetros de tamaño, LSFM se combina en su mayoría con los protocolos de limpieza para hacer las muestras ópticamente transparente. Estas técnicas se basan en la idea de eliminar el agua del respectivo tejido biológico y de intercambiarlo con medios de inmersión a base de disolventes acuosos o orgánicos, los cuales se eligen para ajustarse estrechamente a los índices de refracción de los componentes de tejido diana particulares. Como resultado, la dispersión de luz lateral se minimiza, y todas las longitudes de ondaDe luz puede pasar mucho más eficientemente a través del tejido 13 . En muchos casos, los especímenes biológicos tratados de esta manera aparecen macroscópicamente cristalinos, lo que permite que el LSFM se lleve a cabo, incluso en órganos enteros de ratón, usando objetivos de ampliación de larga distancia de trabajo y de baja ampliación.
Aquí presentamos un protocolo de preparación para la obtención de imágenes de gran muestra en un microscopio de lámina (ver tabla de materiales), que hemos establecido para investigar el infiltrado cardíaco celular en un modelo murino de miocarditis 15 . Los ratones CD11c.DTR expresan el receptor de la toxina diftérica de primate (DTR) bajo el control del promotor 16 de CD11c. En consecuencia, las células de estos ratones, que expresan CD11c junto con el DTR, se hacen sensibles a la exotoxina de Corynebacterium diphtheria (toxina diftérica, DTX); El tratamiento sistémico de estos animales con DTX produce un agotamiento de todos los CD11c + ceLls CD11c es una integrina y, como receptor de la superficie celular para una variedad de diferentes factores solubles, está involucrado en procesos de activación y maduración, principalmente en las células del linaje monocítico [ 17] . En consecuencia, el modelo de ratón CD11c.DTR se ha utilizado intensivamente para estudiar el papel de las células dendríticas y los subgrupos de macrófagos en el contexto de muchas preguntas inmunológicas diferentes. Con el tiempo, se ha reportado que los ratones CD11c.DTR tratados sistemáticamente con DTX pueden desarrollar efectos secundarios adversos y pueden mostrar tasas de mortalidad fuertemente elevadas 18 , 19 . Recientemente, hemos sido capaces de identificar la causa subyacente de la muerte 15 , que describe el desarrollo de miocarditis fulminante después de la aplicación intratraqueal DTX en estos animales. El desafío de la toxina causó la destrucción celular, incluso en las partes centrales del sistema de transmisión del estímulo en el corazón. Esto fue acompañado por un masivo CD45+ Infiltrado de leucocitos, lo que finalmente conduce a arritmias cardíacas letales. En este caso, no sólo fue importante la aparición de la población de leucocitos, sino también su distribución espacial dentro del corazón. Esta pregunta experimental es un desafío para la moderna imagen microscópica, que hemos resuelto por una luz microscopía de la hoja de enfoque que se apoya por la tinción de anticuerpos intravital y un disolvente orgánico basado en el protocolo de compensación óptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la ciencia de la vida moderna, la visualización microscópica de los procesos biológicos desempeña un papel cada vez más importante. En este contexto, se han logrado muchos desarrollos durante los dos últimos siglos que ayudan a responder a preguntas no abordables hasta este punto,. En primer lugar, ha habido una clara tendencia a aumentar fundamentalmente la capacidad de resolución de los microscopios de luz. Con microscopía de iluminación estructurada (SIM) 21 , <sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en el laboratorio de Gunzer recibió el apoyo del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania (subvención nº 0315590 AD) y de la Fundación Alemana de Investigación (GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Agradecemos también al IMCES por el apoyo técnico ya Sebastian Kubat por su ayuda con el modelado de dibujos animados en 3D.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
Riferimenti
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