Summary
このビデオの記事は、組織学的解析と代謝プロファイリングに対する郭清によってマウスの膵臓を正常に削除に必要な手順の詳細なデモを提供します。
Abstract
膵臓特定のトランスクリプション要因、1 a cre リコンビナーゼ; を調査しています。lox 停止-lox クリステン ラット肉腫、12 のコドンでアスパラギン酸グリシン (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) ヒト膵癌のモデルとしてのマウスのひずみ。私たちの現在の研究の目的は、膵臓癌の進行の新規代謝マーカーを識別するためにです。尿、糞便、血液、膵臓組織の抽出物と癌の進行を舞台に膵臓の組織学的解析のメタボリック ・ プロファイリングを行った。マウスの膵臓人間のような明確に定義された固形臓器ではなく、むしろ簡単にマウス内部解剖学になじみのない個人またはほとんどまたはまったく経験を実施して個人識別はないびまん性分散軟部組織マウス臓器の解剖。この資料の目的は、詳細な測定を提供する郭清によりマウスの膵臓の除去には初心者を誘導する視覚的なデモ。この記事は特にメタボリック ・ プロファイリングまたは組織学的解析のため郭清によってマウスの膵臓の収穫が必要研究に学生や新しい研究者に貴重なする必要があります。
Introduction
マウスはヒト膵癌1,2の重要な動物モデルとして登場しました。Ptf1acre/+;LSL KrasG12D/+マウス モデル、クリステンの膵臓、膵上皮内テロメラーゼ (PanINs)、その進歩と呼ばれる、膵臓の病変の開始に終って専らラット肉腫 (K ‐ Ras) 遺伝子が有効膵膵管癌は、一般的には PDACs3と呼ばれます。このマウス モデル システム、ヒト膵癌4、5生活や頻繁に PDAC に進捗状況の最初の 5 ヶ月以内、PanINs が出てくる追加の利点の最高の動物モデルの 1 つ、単一の年4、560-70 歳が人間の膵臓癌が最もよく起きるに対し。
Ptf1a から郭清による膵臓抽出cre/+;LSL KrasG12D/+パニン ・早期から進行 PDAC3,4まで様々 な年齢でのマウスは、膵臓癌の開発の詳細縦断的組織学的検討,5. 5 個から 15 ヶ月に至るまでの年齢層で膵臓の収穫も、準備組織健康から病気にかかったティッシュへの移行中に発生する膵4代謝の世界の変化の特徴を抽出する使用ことができます6,7。
この記事では、マウスの膵臓領域抽出の実行に必要な手順の完全な視覚的なガイドを提示し、膵臓がさらなる分析のための保存のためのガイドラインを提供します。個人を含む、その他の膵疾患の研究を行って I 型糖尿病、特に学生やマウスの膵臓を使っての収穫を含む研究に新しい捜査に役に立つはずのこのガイドは均等に貴重になりますメタボリック ・ プロファイリングまたは組織学的解析の郭清。
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Protocol
ビデオで実施および下記の手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) マイアミ大学によって承認されている
。1。 準備と刺激テスト
手術、手術台、事後操作テーブルの- 確立する 2 つの明瞭な区域。すべての材料と必要な道具と両方のエリアをステージします。
出されたボンネットの下
- ステージ オペレーティング テーブル。プロシージャの継続的かつスムーズなパフォーマンスを可能にする方法で装備テーブルを配置します 。
- は、同じ部屋および操作のメイン テーブルの近くで術後テーブルを確立します。プロシージャ全体で生殖不能の環境として、両方のテーブルを保持します 。
- 次の場所は、オペレーティング テーブルの上供給: 蓋、1 つ 15 mL チューブ、手術用はさみ、70% エタノール、2 つの発泡ボード、2 つの鉗子、シリンジ 1 mL 21 ゲージ、2 つの 50 mL チューブ、1 つ遠心分離機管の 1 つのスクイズ ボトルの 1 つのペアを 1 つのガラスの瓶、1 つのセラム、4 外科パッド、10 ピン、殺菌ワイプのディスペンサー、シャープス コンテナーします。
- は、後の操作テーブルの上次の消耗品を配置: 1 つ分析的なバランス、液体窒素、浅いワイド 4 L デュワー口デュワー、フローティング チューブ ラック、外科はさみのペアを 1 つ、2 つの鉗子、4 つのセラム チューブのディスペンサー 1滅菌ワイプします 。
- ホルマリンで 1 つ 50 mL と 75% のボリュームに 1 つの 15 mL チューブを入力します 。
- 郭清ボードとしておおよそ 30 cm × 30 cm 発泡ボードに 1 つの外科パッドを貼る各コーナーで pin を使用します。操作中に残りの 4 つのピンを使用します。臓器を手術後テーブルに転送する外科パッドで小さい発泡ボードを準備します
。 注意: イソフルラン (99.9%) は、有毒化学物質、排出される麻酔ガス 8 の清掃から安全性の最大レベルを確保するため口のフードで使用する必要があります。イソフルランを使用してオープン アンド ドロップ メソッドを使用してに関連付けられている研究者へのリスクに関する追加情報がテイラーとムック 8 記事 。
- はガラスの瓶にイソフルラン (99.9%) を数滴に浸す外科パッドを配置し、マウス、イソフルランとの直接接触を防ぐために、上にペーパー タオルを配置します。同様に、残りの管ライン、イソフルランを数滴で吸収し、マウスと、イソフルランとの直接接触を防ぐために上に追加のパッドを配置する外科パッドを使用します 。
- 注ぐ液体窒素デュワー最大行を埋めるまでに達する浅い広口にします 。
- マウスの麻酔に郭清のために選択の場所の部屋の すなわち 〜 1 分のふたで覆われてイソフルラン (99.9%) のいくつかを浸したパッド付きのガラス瓶が値下がりしました
注: 今回は、マウスから異なります。マウスが意識、商工会議所から削除し、操作盤の上に配置します 。
- は、科学者から離れて指摘した頭と、腹側が横たわっているようにマウスを合わせます。イソフルラン (99.9%) の数滴を浸した外科パッドとライニング管の頭を置き、マウスの刺激に対して反応されるように足ピンチして刺激テストを実行します。
- 場合は、このテストは失敗し、足ピンチ テストに対するマウスの応答、手順 1.8 。
2。初期の切開、心臓穿刺、安楽死
- 手術の発泡ボードにマウスの四肢をピンし、70% のエタノールでマウスの腹側をウェットします 。
- は、ピンセットで尿道口近くの毛皮をピンチし、若干上向きに引き出します。腹腔正中線を尿道口から始まって、あごで終了を手術用はさみで切開を行います。
- 鉗子で毛皮の皮の 1 つの側面をつかむ最初の切開部の開始の点の近く、別の切開はさみで下方と斜めに背中足に向かってします 。
- は、反対側に同じ方法でこれを繰り返します
。 注: 毛皮の皮より広い開口部を作成する可能性がありますにピンを必要はありません 。
- 心を確認し、注射針の目詰まりを避けるために、心臓の周りの膜である心膜を取り外します。
- は、鉗子で心膜をつかんで、はさみでカットします。慎重に鼓動する心臓に注射針を挿入して心臓穿刺を行い、ゆっくりとピストンを撤回する開始します 。
- 最適な採血、心臓のポンプ作用を模倣し、あまりにもすばやく描画を避けるために針のプランジャーを使用します
。 注: 通常約 1 mL の血液を収集することができます 。
- 血のコレクションを完了すると、遠心管とシャープス コンテナーにシリンジの処分に血を払拭します 。 中心部を接続する添付ファイルを削除することによって安楽死実施
- 心臓穿刺の実行後です
。 注: ヘパリン、抗凝固剤は、この特定における血清コレクションの凝固する血を許可する心臓穿刺する前にこの手順で注射器に追加されませんでした。しかし、研究者は、プラズマを収集するために血液凝固を防ぐために場合は、ヘパリンに追加でした心臓穿刺前にシリンジします 。
- 研究には、マウスの遺伝子型が含まれている場合耳の部分をハサミでチョキンし、遺伝子型検証用遠心管に配置します
3. 膵臓領域抽出
- マウスの左側にある胃を検索します。優しく (避けるために引き裂く) 開始 2 つの鉗子を使用して胃と十二指腸と膵臓を切り離すします
。 注: 胃や腸から膵臓をデタッチする際、非常に重要な臓器から膵臓組織をガイドしていない粉砕したり、鉗子で膵臓を引き裂く優しく鉗子を使用は。- 小腸の空腸および回腸のセクションから膵臓を分離し続けると最後に大腸の盲腸から 。
- 、盲腸で鉗子を再配置および直腸に向けて残りコロンに沿って膵の分離を続行します
。 注: この時点ではカットし、胃から結腸、直腸の直前の領域部分を削除すると便利です 。
- 膵臓と脾臓を添付します。マウスの右側に向かって膵臓をスライドさせます。隣接脾臓と膵臓を完全にデタッチする鉗子で膵臓と胸腔内の残りの関係を区切ります 。
- は、膵臓を外し、検査のためにそれを広げ。識別目的のため膵臓に接続されている脾臓を残します。
- 削除すべて結合組織、膵臓からの脂肪および腸間膜の組織
。 メモ: この組織は色白く、こうして色でピンカーは、膵臓の組織から簡単に区別することができます。これは、膵臓を全削除する必要がある場合に特に重要です。たとえば、膵臓が圧迫され、体重と動物のグループ間比較する必要があります。Ptf1a cre/+;LSL Kras G12D/+ マウス モデル古いヶ月で特に硬線維性膵組織が存在する可能性があります。この場合、腫瘍組織で腸がインター レースにすると膵臓を慎重に除去を実施する必要があります。高度な場合は、異常な脾臓と肝臓組織もあるかもしれない 。
- 削除すべて結合組織、膵臓からの脂肪および腸間膜の組織
- 必要に応じて、この時点で他の臓器を削除します
4 データの収集とストレージ
- 臓器の抽出後、サンプルを保全のため術後のエリアに移動します。 。
- 各器官の重量を量るし、彼らのそれぞれのセラムにそれらを配置します
。 注: ウィットに沿ってh 質量今後の参考のため、各サンプルの任意の不正を記録すべきです 。
- 器官の重量を量ったが、一度スナップ凍結用液体窒素にそれらを配置します 。
- 凍結、スナップ後長期保存用-80 ° C で臓器を格納します 。
- は一晩、ベンチ上ホルマリン保存サンプルを配置し、次の朝は 70% エタノールにホルマリンからのソリューションを変更します
。 注意: これらのサンプルは、長期保存のための 4 ° C で保存する必要があります 。
- 長期保存、凍結-80 ° C で血と耳パンチ。血液から血清コレクション、30 分の凝固し、それを遠心血液を許可します。ピペットを使用して血清部分を削除し、-80 で格納 ° C
5。クリーンアップ
殺菌ワイプ- サニタイズすべての解剖ツール。キャップ、イソフルランの管は手術パッドを浸した。新鮮な外科パッドと発泡ボードの外科パッドを交換してください。処分施設ごと採取されなかったマウスの部分 ' s 動物処分ポリシー 。
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Representative Results
図 1動作環境領域の概要については、図 2のポスト操作領域を示しています。この設定は、機器の最小限の量を提供します、ステージング、個人はこの個々 のニーズに合わせて変更することができます。プロトコルは実験の特定のニーズに合わせて最適化する必要があります。この手順は、マウスの適切な euthanization9を必要とする生活を終了する方法で行われています。研究者は、準備ができて、マウスはイソフルラン浸したパッド (図 3) と麻酔室に配置されます。
マウスが意識、マウスを削除し、基板の背側に配置。つま先ピンチ手順を実行して、マウスが (図 4) の痛みに敏感であることを確認ください。最初の切開部周辺を殺菌する 70% エタノールを適用します。ターミナル血液は、十分な血の取得を確保するため、膵臓の除去の前にまず、実施する必要があります。脱血前に開く 21 G 針の目詰まりを防ぐために、心膜を削除必要があります。ターミナルの血を完了した後を描く、安楽死の副次的な方法として心をデタッチし、膵臓が削除されます。
胃、膵臓の除去 (図 5) のための良い出発点を提供するを配置することによって開始します。注: 繊細で壊れやすい組織である膵臓の除去中に細心の注意を行使しなければならないし、穏やかな力したがってすべての操作は実行する必要があります。鉗子を使用すると、胃から膵臓を軽く引いて始めてで解剖を始めるし、胃から十二指腸、空腸、回腸 (まで働いて胃腸 (GI) 地域の外のライニングから膵組織を分離し続ける図 6)。盲腸に達したら、膵臓を取り外しやすくは 1 つの鉗子は、盲腸を保持している (図 7) にある大腸から膵臓を分離していく他の鉗子を使用する鉗子の再配置によって実現されます。マウスの右側にある大腸から取り出した後、膵臓を配置し、残りの添付ファイル、切断された(図 8)。
膵臓は、検査のため送風されるべきし、異常をする必要があります (図 9) を記録しました。Ptf1acre/+;LSL KrasG12D/+株をマウス膵硬化腫瘍 (図 10) を含む可能性があります。他の臓器は、潜在的な転移も検討すべき。膵臓を削除すると、それが考慮すること、重量が記録されます。膵臓の一部は、将来の代謝プロファイリング分析用の液体窒素でスナップ凍結する必要があります。 または他のテストと、膵臓の一部は、将来の組織学的分析のためのホルマリンでされるべきであります。図 11は、後で分析に使用するため郭清から収集した様々 な器官の初期のストレージを示します。郭清で収集し、さらなる研究を格納されている臓器は、研究者個人の目標によって異なります。
メタボリック ・ プロファイリング、組織学的解析のため、組織や血液サンプルを使用できます。膵臓組織の組織学的解析の例は図 12に示します。スナップ凍結組織サンプルと血液サンプル メタボリック ・ プロファイリングを行うことができます。膵臓組織抽出物の親水性と疎水性成分の代表的な核磁気共鳴分光法 (NMR) スペクトルは図 13 aと13 bにそれぞれ表示されます。ターミナル血描く手順時の血液から調製した血清サンプルの収集した代表的な NMR スペクトルを図 14に示します。
図 1: 動作領域のステージングします。適切なツールと郭清の動作条件の一般的なレイアウト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 後の操業区域のステージングします。適切なツールと術後のプロシージャの動作条件の一般的なレイアウト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 麻酔室。イソフルレンで麻酔のための適切な環境。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 刺激検討します。任意の痛みや不快感を確保するため初期の切開する前にマウスの刺激試験が耐えないです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 膵臓の除去を開始します。膵臓、鉗子によって示される位置の最初の抽出を示すマウスの向き。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 腸に沿って膵臓領域抽出します。消化管から膵臓を分離するプロセス。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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図 7: 盲腸で膵臓削除します。一度盲腸で鉗子の位置に達する。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 膵臓削除します。膵臓をマウスの右側に配置します。残り添付ファイルをカットして、膵臓を完全に削除する必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 膵臓検査します。マウスから取り出した後検討されている添付の脾臓と膵臓。脾臓は、垂直方向の矢印で示され、膵臓は、水平の矢印によって示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: 膵臓検査します。マウスから取り出した後検討されている膵腫瘍を表示する添付の脾臓と膵臓。脾臓は、垂直方向の矢印で示され、膵臓は、水平の矢印によって示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11: 臓器の記憶域。臓器やサンプルの適切なストレージを収集、長期保管し、将来の分析のために準備します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 12: 膵臓組織の組織学的解析.ヘマトキシリンとエオシン染色膵臓組織からの画像です。A) 正常膵組織、Ptf1a からcre/-;LSL KrasG12D/-コントロール マウス。B) パニン ・組織、Ptf1a の膵臓からcre/+;LSL KrasG12D/+研究マウス。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 13: メタボリック ・ プロファイリング解析します。膵臓組織抽出物、クロロホルム ・ メタノール抽出を受ける組織の均質化を次の A) 親水性と B) 疎水性位相成分の一次元プロトン核磁気共鳴分光法 (NMR) スペクトル。NMR スペクトルは 850 MHz で買収され、代謝プロファイリング解析での使用に適しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 14: 血清の代表核磁気共鳴スペクトル。ターミナルの血を描くプロシージャによって集められた血は、代謝プロファイル分析に使用できます。このスペクトルを示します典型的な一次元陽子 850 MHz NMR スペクトル ターミナル血の描画サンプルから得られた血清の収集します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
既存のメソッドの意義
マウス解剖の他の非公式の動画が存在している間このビデオ説明が最初のプロの品質、査読、郭清10 でマウスの膵臓の収穫抽出に必要な詳細な手順のすべての視覚的なデモ.代謝とインスリンの主な器官をされている膵臓に生産、郭清と膵の収穫を生理的特性11の保存のためことができます。膵臓を分離することによって、サンプルの将来の分析を行うことができます。この手順は、比較と同じ時間枠の内で同じ生体内の他の組織からの相互作用の研究。
技術の限界
このプロシージャの最大の制限は、マウスの生命、縦コレクションを防ぐと同じマウスから複数の組織サンプルのサンプリングの終了です。断面人口は年齢、性別、または他の量指定子の動向を分析するためには実装する必要が膵臓癌の代謝性バイオ マーカーの研究を行った。このプロトコルのもう一つの制限は、プロシージャを一時停止することができないことです。Euthanization が開始されると、プロシージャはそのままの状態で実施する必要があります。
プロトコルの中で重要なステップ
マウスの後肢をつまんで刺激テストの実行は、マウスが人道的な扱いを受けることを確保するため重要です。マウスは、この刺激には反応しない場合、プロシージャ行われる計画通り。ただし、マウスは苦しめられた応答刺激テストの結果を表示する、マウスが返されます麻酔室に追加期間時間とテストを繰り返し、刺激テストへの反応は、12を観測されていません。
同様に、ターミナル心臓穿刺は、安楽死の二次的な方法により、マウスの慈悲深い犠牲としてターミナルの血液サンプルが収集された後にすぐに心に接続の除去が続きます。効果的な血液を確保するため、科学者使用してくださいポンプの動きマウスの心臓の鼓動に似ている注射器と解析のための血のコレクションの最大を可能にします。
変更とトラブルシューティング
70% エタノール溶液にホルマリンから臓器を切り替える組織学的解析のために必要な埋め込みプロセスのための器官を準備します。さまざまなストレージ ・ ソリューションがあります必要な臓器と他の実験を実行する科学者を選択する必要。分析の前に、器官の整合性を維持するために-80 ° C のフリーザーで保存されている臓器の任意の潜在的な解凍を制限することが重要です。
Ptf1a の使用cre/+;LSL KrasG12D/+マウス モデルは非膵の主腫瘍や病気の13の発生を最小限に抑えます。したがって、郭清と分析のための組織サンプルのコレクションの中に膵臓や他の臓器には明らかにある凹凸に注意する重要です。
将来のアプリケーション
郭清によってマウスの膵臓の収穫で、複数の種類の分析の同じサンプル上で実施することができます。これらの最も人気のあるなどが、蛍光顕微鏡、ヘマトキシリンとエオシン組織、免疫組織化学、質量分析、核磁気共鳴分光法6,7、に限定されません。14,15. 糖尿病、膵炎、膵臓癌などの病気は16上記の技術を使用して学ぶことができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
MAK は、国立衛生研究所からこの作品のサポートを認めている/国立がん研究所許可番号 - 1R15CA152985 01A1。このプロジェクトは、マイアミ大学学部研究賞プログラム、奨学金プログラムとマイアミ大学夏学者プログラムにマイアミ大学博士課程工学部機会によってサポートされています。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Glass Jar | Corning | 3140-150 | The glass jar used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
Lid of Glass Jar | Corning | 9985-150 | The glass jar lid used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339650 | |
Surgical Scissors | Fisher Scientific | 9201 | |
Squeeze bottle | Fisher Scientific | 03-409-10DD | |
100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
Formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
Foam Boards | Therapak | 562908 | |
Forceps | Fisher Scientific | 200205SHN | |
1 mL 21G Syringes | BD Biosciences | 309624 | |
50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339652 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-681-258 | |
Surgical Pads | Fisher Scientific | S67011 | |
T-Pins Length: 2" | Advance Store Products | X32T-05 | |
Sterilizing Wipes | Professional Disposables International Inc. | Q85084 | |
Sharps Container | Fisher Scientific | 14-827-122 | |
Analytical Balance | Marshall Scientific | ME-AE200 | |
4L Dewar | Taylor-Wharton | 4LD | |
Shallow Wide Mouth Dewar | Fisher Scientific | F3087-V | |
Floating Microtube Rack | VWR | 60986-100 | |
Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile | Fisher Scientific | 10-500-25 | |
Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
Liquid Nitrogen | Wright Brothers | NIT-60-XX | |
Mouse Kras Strain | The Jackson Laboratory | OO8179 | |
Mouse Cre Strain | MMRRC | OOO435-UNC |
References
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