Summary
यह प्रोटोकॉल एक एनएलएस-एनईएस-जीएफ़पी प्रोटीन के परमाणु आयात में वास्तविक समय में बदलाव को बढ़ाकर मोटर न्यूरॉन जैसी एनएससी -34 कोशिकाओं के भीतर न्यूक्लूसियोप्लास्मिस्टिक ट्रांसपोर्ट रेट को संवेदनशील तरीके से मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन सेल नाभिक से बड़े अणुओं के आयात और निर्यात को संदर्भित करता है। हाल ही में, कई अध्ययनों में एमीयोथ्रोफिक पार्श्व स्केलेरोसिस (एएलएस) और न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मेक मार्ग में हानि के बीच एक कनेक्शन दिखाया गया है। एएलएस मोटर न्यूरॉन्स को प्रभावित करने वाली एक neurodegenerative रोग है और जिसके परिणामस्वरूप पक्षाघात और अंततः मृत्यु में, औसतन 2-5 वर्षों के भीतर। ए एल एस के अधिकांश मामलों छिटपुट हैं, जो किसी भी स्पष्ट आनुवंशिक संबंध की कमी है, लेकिन 10% एक प्रभावी तरीके से विरासत में मिला है। हाल ही में, क्रोमोज़म 9 खुले पढ़ने के फ्रेम 72 (सी 9orf72) जीन में हेक्सान्यूक्लियोटाइड दोहराए विस्तार (एचआरई) की पहचान एएलएस और फ्रंटोटेमपोरल डिमेंशिया (एफटीडी) के आनुवंशिक कारण के रूप में की गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न समूहों ने हाल ही में प्रस्तावित किया है कि ये म्यूटेंट न्यूक्लूसोसाइटोप्लास्मिक परिवहन को प्रभावित करते हैं। इन अध्ययनों में ज्यादातर न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन पर एचआरई की वजह से अंतिम परिणाम और अभिव्यक्तियों को दिखाया गया है, लेकिन वे परमाणु परिवहन संबंधी समस्या का प्रदर्शन नहीं करते हैंरियल टाइम। नतीजतन, केवल गंभीर न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन की कमी का निर्धारण किया जा सकता है, अधिकतर उच्च ओवर एक्सप्रेसन या बहिर्जात प्रोटीन प्रविष्टि के कारण।
यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय में न्यूक्लोकॉस्प्टोस्लॉजिकिक ट्रांसफिकेशन डिस्फ़क्शन के मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक नया और बहुत ही संवेदनशील परख का वर्णन करता है। एक एनएलएस-एनईएस-जीएफपी प्रोटीन (शटल-जीएफपी) के आयात की दर को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में मापा जा सकता है। यह एक निर्यातिन अवरोधक का उपयोग करके किया जाता है, जिससे शटल जीएफपी केवल नाभिक में प्रवेश करने की अनुमति देता है। परख को मान्य करने के लिए, C9orf72 एचआरई अनुवादित दोहराव दोहराता है, पाली (जीआर) और पाली (पीआर), जो पहले से न्यूक्लियोकॉप्टोस्लैमिक परिवहन को बाधित करने के लिए दिखाया गया था, का उपयोग किया गया था। वर्णित परख का उपयोग, नियंत्रण की तुलना में परमाणु आयात दर में 50% कमी देखी गई। इस प्रणाली का उपयोग करते हुए, न्यूक्लूसोप्टोस्लैमिक परिवहन में मिनट के परिवर्तन की जांच की जा सकती है और विभिन्न कारकों की क्षमता (यहां तक कि आंशिक रूप से) एक न्यूक्लियोक्साइटप्लास्मिक ट्रAnsport दोष निर्धारित किया जा सकता है
Introduction
परमाणु ताकना जटिल (एनपीसी) सेल नाभिक में और बाहर बड़े अणुओं के आयात और निर्यात को नियंत्रित करता है। छोटे अणुओं के विपरीत, जो विनियमन 1 के बिना नाभिक में प्रवेश कर सकते हैं, बड़े अणुओं के परिवहन को एनपीसी द्वारा दृढ़ता से नियंत्रित किया जाता है। इन बड़े अणुओं जैसे कि प्रोटीन और आरएनए, आयातकों और निर्यातकों सहित परिवहन कारकों के साथ सहयोगी, को नाभिक 2 से आयात और निर्यात किया जा सकता है। आयात करने के लिए, प्रोटीन में एक छोटा पेप्टाइड आकृति होती है, जिसे आम तौर पर एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) कहा जाता है, जो कि आयातकों द्वारा बाध्य होती है 2 । एमिनो एसिड के ये अनुक्रम एक टैग के रूप में कार्य करते हैं और रचना 3 , 4 में विविध हैं। निर्यातक के साथ उनके सहयोग के कारण प्रोटीन को नाभिक से सीओप्लाज्म में निर्यात किया जा सकता हैएस, जो एक सिग्नल अनुक्रम बाँधते हैं, जिसे आम तौर पर परमाणु निर्यात संकेत (एनईएस) 2 कहा जाता है छोटे रास से संबंधित परमाणु प्रोटीन जीटीपेज (रेन) 2 के विनियमन के कारण आयातकों और निर्यातकों दोनों ही अपने माल को परिवहन में सक्षम हैं। विभिन्न गठनात्मक राज्यों में चलने का अस्तित्व दिखाया गया है, इस पर निर्भर करता है कि क्या वह जीटीपी या जीडीपी के लिए बाध्य है या नहीं। जब जीटीपी के लिए बाध्य है, तो रन आयातकों या निर्यातकों से जुड़ा हो सकता है। रान जीटीपी के लिए बंधन पर आयातकों ने अपना माल छोड़ दिया, जबकि निर्यातकों को अपने निर्यात कार्गो के साथ एक जटिल बनाने के लिए रान जीटीपी को बाध्य करना चाहिए। प्रमुख न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी स्थिति, नाभिक (RanGTP) या साइटोप्लाज्म (रानजीडीपी) में अपने स्थान पर निर्भर करती है।
हाल ही में, कई अध्ययनों से न्यूक्लोकॉटेप्लस्मेक मार्ग में अपर्याप्तता और दोनों एमीट्रोफिक पार्श्व कैंसर (एएलएस) और फ्रंटोटेमपोरल डिमेंशिया (एफटीडी) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 एएलएस एक प्रगतिशील और घातक neurodegenerative रोग दोनों ऊपरी और निचले मोटर न्यूरॉन्स (एमएनएस) 13 को प्रभावित करता है और जिसके परिणामस्वरूप पक्षाघात और अंततः मृत्यु में, औसतन 2-5 वर्षों के भीतर। एएलएस के अधिकांश मामलों को छिटपुट (एसएएलएस) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जिसमें कोई भी स्पष्ट आनुवंशिक संबंध नहीं होता है, लेकिन 10% एक प्रभावी तरीके से विरासत में मिला है (पारिवारिक एएलएस; FALS)। हाल ही में, क्रोमोज़म 9 खुले पढ़ने के फ्रेम 72 (सी 9orf72) जीन में हेक्साएनक्लियोटाइड दोहराए विस्तार (एचआरई) 14 , 15 को एएलएस और एफटीडीए के आनुवांशिक कारण के रूप में पहचाने गए थे। इन म्यूटेंट के कारण फलों के मामलों के 30-40% मामलों 16 के लिए है , और विभिन्न अध्ययनों का तर्क हैकि वे न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 को प्रभावित करके विषाक्तता का कारण बनाते हैं।
इन अध्ययनों में ज्यादातर न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन पर एचआरई के अंतिम परिणाम और अभिव्यक्तियों को दिखाया गया है, लेकिन वे वास्तविक समय में न्यूक्लियोक्साइटप्लाज्मिक व्यवधान का प्रदर्शन नहीं करते हैं। नतीजतन, केवल गंभीर न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन की कमी 11 , 17 , 18 का मूल्यांकन किया गया है।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक नया और veवास्तविक समय में न्यूक्लोकॉस्प्टोस्लॉजिकिक ट्रांसफिकेशन डिसिंकक्शन का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए संवेदनशील संवेदनशील परीक्षण। एक एनएलएस-एनईएस-जीएफपी प्रोटीन (शटल-जीएफपी) के आयात की दर को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में मापा जा सकता है। यह एक निर्यातिन अवरोधक का उपयोग किया जाता है, जैसा कि पहले 18 वर्णित है, इस प्रकार शटल-जीएफ़पी को केवल नाभिक में प्रवेश करने की इजाजत देता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट परिवर्तनों को मापने में सक्षम एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह नाभिक में स्थित शटल-जीएफपी की प्रतिदीप्ति तीव्रता में क्रमिक परिवर्तनों को मापना संभव है। नतीजतन, किसी भी समय पर परमाणु शटल-जीएफपी की मात्रा का प्रतिनिधित्व करने वाली प्रतिदीप्ति-टू-टाइम अक्ष का एक माइकलिस-मेन्टन-जैसी संतृप्ति वक्र, बनाया जा सकता है। घटता की प्रारंभिक रैखिक दर का उपयोग करके, एक ढलान उत्पन्न करना संभव है, जो प्रतिदीप्ति संतृप्ति से पहले नाभिक में प्रवेश की दर को दर्शाता है।
परख को मान्य करने के लिए, अनुवादडी C9orf72 dipeptide दोहराता है, पाली (जीआर) और पाली (पीआर), जो पहले न्यूक्लूसोप्लास्मिक परिवहन को बाधित करने के लिए सूचित किया गया था, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 का इस्तेमाल किया गया था। इस परख का उपयोग, नियंत्रण की तुलना में परमाणु आयात दर में 50% कमी देखी गई। इस प्रणाली का उपयोग करना, न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन में मिनट के परिवर्तन की जांच हो सकती है। इसके अलावा, एक न्युक्लोकॉस्प्टोस्मेस्की परिवहन दोष को बचाव करने के लिए विभिन्न कारकों की क्षमता निर्धारित की जा सकती है।
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Protocol
1. सेल लाइन तैयारी
- करीब 1,000,000 माउस न्यूरोब्लास्टोमा स्पाइनल कॉर्ड कोशिकाएं (एनएससी -34 कोशिकाएं) जो एक तरल नाइट्रोजन कंटेनर में संग्रहीत होती थी। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के इनक्यूबेटर का उपयोग करें जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से पिघल नहीं किया जाता है।
- ताजा, गर्म मध्यम (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (1 FB), 1% एल-ग्लूटामाइन और 1% पेन-स्ट्रेप एंटीबायोटिक युक्त डीएमईएम माध्यम जोड़ें)।
- एक सेल गोली बनाने, 5 मिनट के लिए 500 xg पर अपकेंद्रित्र थक कोशिकाओं (SL16R)। मध्यम रिसावमेंट के लिए मध्यम निकालें और नए माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
- 15 एमएल फ्लास्क में रिज्यूस्ड सेल रखें और एक अतिरिक्त 5 एमएल का माध्यम जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ बाँझ इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रातोंरात सेते हैं।
- समानांतर में, 60 मिमी संस्कृति वाले डिब्बे में 8 अप्रभाजित कंडोली (कवर ग्लास: 12 मिमी, 0.13-0.17 मिमी मोटी) रखें और 70% इथेनॉल का उपयोग करें और 30 मिनट की यूवी प्रकाश के संपर्क में जब तक यह सूखा न हो जाए। प्रत्येक डिश में मध्यम जोड़ें और अवशिष्ट इथनॉल को धोने के लिए डिस्पोजेबल करें।
- कोशिका में ट्रिप्सिन बफर (ट्रिप्सिन का 2.5 ग्राम और हेंक्स के संतुलित एलसीडी के 0.2 लीटर 0.2 ग्रै) को जोड़ने के बाद सहायक कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देने के लिए लगभग 9 0% संगम (लगभग 5 लाख कोशिकाएं फ्लास्क) तक पहुंचें।
नोट: एनएससी -34 कोशिकाएं संवेदनशील हैं और माध्यम के माध्यम से पृथक्करण से पहले ही ट्रिप्सिन बफर इन्सुबेशन के 15 एस और ट्रिप्सिन से 1 अतिरिक्त मिनट ऊष्मायन की आवश्यकता होती है। - कोशिकाओं को 60 मिमी संस्कृति व्यंजन पर पहले से ही 3 एमएल मध्यम, लगभग 350,000 प्रति डिश के साथ कंडोली युक्त होते हैं। इनवेबेटर में 24 घंटे के लिए उन्हें कवरलिप्स पर सेल लगाए जाने की अनुमति दें।
2. सेल अभिकर्मक
नोट: लगभग 24 घंटे के बाद, एनएससी -34 कोशिकाएं 40% संगम (लगभग 800,000 कोशिकाओं) तक पहुंचेंगी और अभिकर्मक के लिए तैयार होंगी।
- बाँझ microcentrifuge टब में शुद्ध DMEM माध्यम (प्रत्येक 60 मिमी संस्कृति डिश के लिए 300 μL DMEM माध्यम) तैयार करेंतों।
- प्रत्येक DMEM युक्त microcentrifuge ट्यूब अभिकर्मक के लिए आवश्यक प्रत्येक प्लाज्मिड के 2 μg जोड़ें।
नोट: शटल-जीएफ़पी प्लाज्मिड सभी सेल ट्रान्सफ़ेक्शन में अनिवार्य है। - सभी माइक्रोसेंटप्रूफ्यूज ट्यूबों में अभिकर्मक जोड़ें जो कि उनके आवश्यक प्लास्मिड होते हैं। यहां, प्रत्येक 2 माइक्रोग्राम डीएनए के लिए वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक के 4 μL जोड़ें।
- डीएमईएम, प्लास्मिड, और अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त माइक्रोप्रोक्सीव्यूज ट्यूबों भंवर और उन्हें 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
- प्रत्येक सूक्ष्मदर्शी ट्यूब को एक कल्चर डिश में जोड़ें और धीरे से डिश को एक समरूप समाधान बनाने के लिए हल करें। पकवान को 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
नोट: चूंकि शटल-जीएफपी को सभी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाना चाहिए, शटल-जीएफ़पी अभिकर्मक दक्षता आंशिक रूप से जांच की जा सकती है और रातोंरात अभिकर्मक के बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूर्व-परीक्षण किया जा सकता है। गैर-फ्लोरोसेंट व्यक्त प्रोटीन की एक पूर्ण परीक्षा एक immunoblot analys का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता हैहै।
3. माइक्रोस्कोपी
- एक कवरलिप धारक के पास ट्रांसस्केक्टेड एनएससी -34 कोशिकाओं वाले कवरलाइट संलग्न करें और अलग मृत कोशिकाओं को निकालने के लिए फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ धीरे से धो लें।
- उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ एक हरे फ्लोरोसेंट फिल्टर का उपयोग करके उपयुक्त सेल पैच को पहचानें।
नोट: एक उपयुक्त सेल पैच को एक बड़ी संख्या में कोशिकाओं (एक क्षेत्र में 20-30 कक्ष) दिखा रहा है और जिसमें नाभिक कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से परिभाषित हैं देखने के एक खुर्दबीन क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है। सेल पैच के भीतर सेल नाभिक को पहली बार आंख से पहचाना जाता है और इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा मैन्युअल रूप से चिह्नित किया जाता है। - सूक्ष्मदर्शी के तहत कन्स्पिलियों पर बफर टपकाकर एक निर्यातिन -1 अवरोधी लेप्टोमिसिन बी (एलएमबी) बफर जिसमें पीबीएस में पीबीएस में 10 एनजी / एमएल एलएमबी युक्त 200 μएल जोड़ें।
नोट: समय में यह बिंदु अंतराल शून्य के रूप में सेट है। - लगभग 400-500 एस के लिए 3 एस अंतराल में चिह्नित नाभिक की फ्लोरोसेंट तीव्रता को बढ़ाएं।
4. विश्लेषण
नोट: चूंकि अलग-अलग कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट शटल-जीएफपी के विभिन्न स्तरों को व्यक्त किया जाता है, इसलिए प्रत्येक सेल की परमाणु फ्लोरोसेंट तीव्रता को अपनी प्रारंभिक फ्लोरोसेंट तीव्रता में सामान्य करना महत्वपूर्ण है।
- उस नाभिक के शुरुआती छह अंतराल के औसत के साथ प्रत्येक नाभिक के 3-फ्लोरोसेंट अंतराल को विभाजित करके चिह्नित नाभिक की फ्लोरोसेंट तीव्रता को सामान्य करें।
- प्रत्येक नाभिक के सामान्यीकरण के बाद, प्रत्येक कोशिका पैच के लिए समय के फ़ंक्शन के रूप में नाभिक प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करने वाले एक फ्लोरोसेंट तीव्रता वक्र का उत्पादन करें। ऐसा करने के लिए, प्रत्येक सेल-पैच (प्रत्येक पैच में लगभग 20-30 कोशिकाओं से मिलकर) में सभी कोशिकाओं के औसत की गणना करें
नोट: नाभिक फ्लोरोसेंट तीव्रता वक्र एक माइकलिस-मेन्टन संतृप्ति वक्र जैसा दिखता है, जो कि वृद्धि हुई टी के भीतर बेहतर देखा जाता हैमुझे समय यह परमाणु परिवहन के कारण समय के साथ शटल-जीएफपी की साइटोसोलिक मात्रा में कमी के कारण है। इस कमी ने सांख्यिकीय को नाभिक में स्थानांतरित करने के लिए शटल-जीएफपी की संभावना को कम कर दिया है, इस प्रकार परमाणु प्रतिदीप्ति में संतृप्ति तक पहुंच रहा है। वक्र के रैखिक प्रारंभिक दर से प्राप्त ढलान नाभिक में वी अधिकतम प्रवेश दर पैदा करता है। - प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह का प्रतिनिधित्व करने वाला ढलान बनाने के लिए ग्राफ़िंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, तीन से पांच स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त प्रत्येक सेल पैच के वी अधिकतम ढलानों का विश्लेषण करें। एकमात्र एनोवा सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करके मात्रा का ठहराव करना।
5. प्रोटीन अभिव्यक्ति मान्यता
- बर्फ पर प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह से अवशिष्ट कोशिकाओं (उपरोक्त प्रयोग में उपयोग नहीं किया गया) युक्त 60 मिमी संस्कृति व्यंजन रखें।
- मध्यम निकालना और पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने और शेष माध्यम को धोने।
- 200-400 के साथ कोशिकाओं का इलाज करेंपीबीएस, 0.5% ट्रिटन, और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल टैबलेट (पीआई) वाले लिसन बफर के μL। एक सेल खुरचनी का उपयोग कर परिमार्जन।
- सूक्ष्मदर्शी ट्यूब में lysis बफर में कोशिकाओं को ले लीजिए और आइस के नीचे 1 मिनट के लिए 4,000 आरपीएम पर homogenizer के साथ होमोजेनीज करें।
- 10 मिनट के लिए 2500 xg में homogenized कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला लीजिए, ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करते हुए प्रोटीन एकाग्रता का परिमाण, और -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग होने तक स्टोर करें
- कुल प्रोटीन (प्रोटीन के आधार पर) के 30 से 70 माइक्रोग्राम के बीच लीजिए और एक एसडीएस पेज जेल में एक इम्यूनोबलॉट परख का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण करने के लिए लोड करें।
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Representative Results
यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना, मोटर न्यूरॉन जैसी एनएससी -34 कोशिकाओं को एनएलएस-एनईएस-जीएफपी (शटल-जीएफपी) प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था यह प्रोटीन, जिसमें एनएलएस और एनईएस सिग्नल अनुक्रम ( चित्रा 1 ) है, नाभिक और कोशिका द्रव्य के बीच शटल कर सकते हैं। जेनेरिक जीएफपी नाभिक में प्रवेश कर सकते हैं या किसी भी स्थानीयकरण सिग्नल टैग की अनुपस्थिति में केवल नाभिक में प्रवेश कर सकते हैं और इसलिए नाभिक और कोशिका द्रव्य ( चित्रा 2 ए ) के बीच समान रूप से वितरित किया जाता है। इसके विपरीत, शटल-जीएफ़पी प्रोटीन ज्यादातर एनईएस और एनएलएस सिग्नल के कारण इसके फैलाव ( चित्रा 2 बी ) को प्रभावित करने के कारण सीओप्टलमाज़ में पाए जाते हैं। इस प्रकार, निर्यातिन अवरोधी लेप्टोमाइसिन बी (एलएमबी) के अलावा, जो प्रोटीन निर्यात को रोकता है, शटल-जीएफपी को नाभिक में जमा करने और अंततः शटल-जीएफपी आयात दर ( चित्रा 2 सी ) के माप के लिए अनुमति देता है। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करना और वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट परिवर्तनों को मापने के लिए एफटीवेयर, शटल-जीएफ़पी की परमाणु प्रतिदीप्ति तीव्रता में क्रमिक परिवर्तन मात्रा में किया जा सकता है। नतीजतन, किसी भी समय पर परमाणु शटल-जीएफपी की मात्रा का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रतिदीप्ति-टू-टाइम अक्ष ( चित्रा 3 ) की एक माइकलिस-मेन्टन-जैसी संतृप्ति वक्र का उत्पादन किया जा सकता है। घटता की प्रारंभिक रैखिक दर ( चित्रा 3 में इंगित के अनुसार), एक ढलान, जो प्रतिदीप्ति संतृप्ति से पहले नाभिक में प्रवेश की दर का प्रतिनिधित्व करता है, का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है।
कई अध्ययनों से पता चलता है कि विभिन्न C9orf72 प्रोटीन ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मॉडल और / या सुसंस्कृत कोशिकाओं 6 , 11 में विषाक्त हैं। उत्परिवर्तित C9orf72 जीन में एचआरई से निर्मित डि पेप्टाइड दोहराता (डीपीआर), पाली (पीआर) और पाली (जीआर), न्यूक्लियोलर तनाव को उत्पन्न करने के लिए पाए गए 8 ,Lass = "xref"> 1 9 , 20 और उन्हें बिगड़ा हुआ न्यूक्लोकॉस्प्टोस्लैमिक परिवहन में फंसाया गया है, जिससे उन्हें विशेष रूप से हानिकारक दिखाई पड़ता है। वर्णित परख की उपयोगिता की पुष्टि करने के लिए, मोटर न्यूरॉन जैसी एनएससी -34 कोशिकाओं को इन दो डीपीआर प्लास्मिड, पॉली (पीआर) और पॉली (जीआर) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। चूंकि पाली (पीआर) और पाली (जीआर) डीपीआर भी जीएफपी से संयुग्मित हैं, यह मान्य करना महत्वपूर्ण है कि डीपीआर भी लेप्टोमायसिन-बी से प्रभावित नहीं थे, जिसके परिणामस्वरूप एक झूठी सकारात्मक परिणाम होगा। पॉली (पीआर) की अभिव्यक्ति नाभिक में पूरी तरह से समावेशन के रूप में देखी गई; इस प्रकार, यह एक झूठी सकारात्मक परमाणु आयात संकेत ( चित्रा 4 ए ) नहीं दे सकता था। दूसरी तरफ, पॉली (जीआर) अभिव्यक्ति, साइटोसोल में समरूपता और नाभिक ( चित्रा 4 बी ) में समावेशन के रूप में देखी गई थी। एनएससी -34 कोशिकाओं को केवल पाली (जीआर) के साथ ट्रांसप्लाइंग करते हुए और लेप्टोमाइसिन-बी जोड़ते वक्त व्यक्त की गई पाली (जीआर) का कोई शटल आंदोलन नहीं देखा गया ( चित्रा 5 )।
चित्रा 5 ) के रूप में एक खाली प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की गई कोशिकाओं की तुलना में लगभग 50% की परमाणु आयात दर में कमी दिखा रहा है।
चित्रा 1: एनएलएस-एनईएस-जीएफपी (शटल-जीएफपी) का निर्माण योजनाबद्ध। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: लेप्टोमाइसिन बी एनएससी -34 कोशिकाओं के नाभिक से शटल-जीएफपी के निर्यात को रोकता है। एनएससी -34 कोशिकाओं की प्रतियांसामान्य जीएफपी ( ए ) या शटल-जीएफ़पी प्रोटीन ( बी ) से पहले और 10 एनजी / एमएल लेप्टोमॉईसिन बी (एलएमबी) ( सी ) के अतिरिक्त के बाद 20 मिनट के लिए रिसाईंग। एलएमबी अतिरिक्त के बाद, शटल-जीएफपी नाभिक में आयात करता है, लेकिन वापस साइटोप्लाज्म के निर्यात को अवरुद्ध कर दिया जाता है। इस प्रकार, शटल-जीएफपी नाभिक में जम जाता है। स्केल बार = 15 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: परमाणु प्रतिदीप्ति में वृद्धि दर्शाते हुए माइकलिस-मेंटन जैसी साजिश प्रतिनिधि माइकलिस-मेन्टेन जैसे दो समूहों के परमाणु प्रत्यारोपण में वृद्धि को दर्शाए गए घटता, 25 मिनट के भीतर, प्रभावित और गैर-प्रभावित न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक ट्रांसपोर्ट कोशिकाएं शुरुआती 5 मिनट में वृद्धि दर में एक उच्च अंतर दिखाई देता है, जो डी हैसमय के साथ उत्साहित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: एनएससी -34 कोशिकाओं में C9orf72 डीपीआरएस पॉली (पीआर) और पॉली (जीआर) अभिव्यक्ति। एन 9 4 9 72 डीपीआर, पाली (जीआर) ( ए ) और पाली (पीआर) ( बी ) के साथ एनएससी -34 कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियाँ हैं। पॉली (जीआर) को कोशिकाओं के नाभिक में व्यक्त किया जाता है लेकिन इसे साइटोसॉल में समरूप रूप से वितरित किया जाता है। पॉली (पीआर) मुख्य रूप से नाभिक में व्यक्त की जाती है स्केल बार = 30 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: C9orf72 डीपीआर, पाली (पीआर) और पाली (जीआर) एनएससी -34 कोशिकाओं पर परमाणु आयात दर को जोरदार रूप से रोकती हैं। मोटर न्यूरॉन जैसी एनएससी -34 कोशिकाओं को शटल-जीएफ़पी के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, एक साथ खाली प्लाज्मिड, पाली (पीआर) या पाली (जीआर) के साथ। परमाणु आयात की दर वी अधिकतम पर वक्र की प्रारंभिक रैखिक दर के ढलान के रूप में परिभाषित की गई थी। खाली प्लाज्मिड के साथ प्राप्त परिवहन दर 100% के रूप में परिभाषित किया गया था। पॉली (पीआर) और पाली (जीआर) के साथ सह-अभिकर्मक, नियंत्रण की तुलना में लगभग 50% की दर को रोकता है। एक तरफ एनोवा का उपयोग करके तीन से पांच स्वतंत्र प्रयोगों पर मात्रात्मक विश्लेषण किया गया। **** p <0.0001; *** पी <0.001 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यह प्रोटोकॉल एक बेहद संवेदनशील और मात्रात्मक नई परख को दर्शाता है जो कि न्यूक्लियोकॉप्टोस्लास्मिक परिवहन में मिनट के परिवर्तनों का मूल्यांकन करता है। इस प्रणाली का प्रयोग करके, वास्तविक समय में न्यूक्लोकॉस्टिकलॉजिकल परिवहन और इसकी समस्या का निरीक्षण करना और मापना संभव है, न केवल बड़े दोष जो कि प्रोटीन वितरण में नाटकीय परिवर्तन का परिणाम है। इस परख को केवल संवेदनशीलता लाभ नहीं है, लेकिन इसमें थोड़ा तैयारी की भी आवश्यकता है, सस्ती है, और यह एक बहुत ही आसान और निम्न-सहभागिता परख है।
इस प्रणाली की दक्षता का परीक्षण करने के लिए, सी 9orf72 प्रोटीन, पाली (जीआर) और पाली (पीआर) डीपीआर, एएलएस और एफटीडी के मॉडल जिन्हें पहले न्यूक्लूसोसाइटॉप्लास्मिक परिवहन की कमी के कारण दिखाया गया था, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 का इस्तेमाल किया गया था। इस परख का उपयोग करना, वास्तविक समय में प्रदर्शित करना संभव था, में लगभग 50% की कमीएक नियंत्रण वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की गई कोशिकाओं की तुलना में डीपीआर को व्यक्त कोशिकाओं में परमाणु आयात दर। इसलिए, इस प्रणाली ने nucleosytoplasmic परिवहन में आसानी से छोटे परिवर्तनों को मापने की संभावना खुलती है, जो इन और अन्य एएलएस या एफटीडी म्यूटेंट या अन्य रोगों के कारण हो सकते हैं जिसमें न्यूक्लोकोसाइटोप्लाजिक परिवहन में संभावित दोष मौजूद हो सकते हैं। हालांकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल मोटर न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं से संबंधित है, यह आसानी से अन्य सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रणाली का उपयोग करना, अब यह तय करना संभव है कि अलग-अलग आणविक कारक या दवाएं एएलएस, एफटीडी, या अन्य विकारों में बचाव या बचाव (यहां तक कि आंशिक रूप से) न्यूक्लोकॉस्टिकस्थल की कमी के कारण मदद कर सकती हैं।
इस परख का उपयोग करने में एक संभावित सीमा है, कोशिकाओं में सेल नाभिक का निरीक्षण और निशान लगाने की सीमित क्षमता है, जिनके पास स्पष्ट नाभिक नहीं है या जो कि बहुत छोटी है। इस पर काबू पाने के लिए, संभव समाधान एक बड़ा शानदार उपयोग करने के लिए हो सकता है समझना। हालांकि, यह अंततः प्रत्येक सेल पैच में कोशिकाओं की मात्रा कम कर देगा, इस प्रकार एक महत्त्वपूर्ण मूल्य तक पहुंचने के लिए आवश्यक प्रयोगों की मात्रा बढ़ाना।
एक और विचार एलएमबी के अलावा शटल-जीएफपी नाभिक-टू-साइटोप्लाज्म अनुपात से संबंधित है। ये अनुपात अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं में बहुत भिन्न हो सकता है और फलस्वरूप एक दृश्य केंद्र को दिखाने के लिए बहुत कम (1: 1 अनुपात के करीब) हो सकता है। एक संभावित समाधान पहले परमाणु मार्कर का उपयोग करना है यह अंतिम विश्लेषण को प्रभावित नहीं करेगा, क्योंकि प्रत्येक सेल अपने मूल परमाणु प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत है। इसके अलावा, इस परख परमाणु प्रतिदीप्ति में इष्टतम वृद्धि का पालन करने के लिए इस परख से पहले निर्यात करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एलएमबी की एकाग्रता को मापने की सिफारिश की जाती है।
एएलएस 5 में मोटर न्यूरॉन्स के अवमूल्यन में मुख्य भूमिका निभाने के लिए न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन की कमी का सुझाव दिया गया है ,= "Xref"> 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 अगर ऐसा मामला है, तो इसी तरह के न्यूक्लियोक्साइटप्लास्मिक परिवहन दोष, जो कि सी 9orf 72 मॉडल में मनाए गए हैं, उन्हें अन्य एएलएस मॉडलों में एक भूमिका निभाने का अनुमान लगाया जाएगा। हालांकि, विभिन्न मॉडलों के बीच बड़ी परिवर्तनशीलता के कारण, प्रत्येक मामले में न्यूक्लूसोप्लेस्मेक विघटन के परिणामस्वरूप अंतिम परिणाम और आणविक अभिव्यक्तियां अनदेखी या फेनोटाइपिक रूप से भिन्न हो सकती हैं। विभिन्न FALS मॉडल पर व्यापक शोध के बावजूद, उन्हें सामान्य तंत्र के साथ जोड़ना एक चुनौती है। यह परख अब कम से कम आंशिक रूप से, इस चुनौती को दूर करने का अवसर प्रदान कर सकता है।
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Disclosures
लेखक को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
हम अपने सहायक टिप्पणियों और सुझावों के लिए एआई प्रयोगशाला के सभी सदस्यों का धन्यवाद करते हैं। हम शटल-जीएफपी वेक्टर प्रदान करने के लिए प्रो। मार्क हिप्प (जैक्सैमिस्ट्री के मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को इज़राइली साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ # 124/14), बिजनेस साइंस फाउंडेशन (बीएसएफ # 2013325), एफपी 7 मैरी क्यूरी कैरियर इंटीग्रेशन ग्रांट (सीआईजी # 3337 9 4), और इसराइल में मनोवैज्ञानिक के लिए राष्ट्रीय संस्थान एनआईपीआई # बी 133-14 / 15)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A | |
| DMEM 4.5 g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 | |
| Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick | Bar Naor LTD | ||
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 | |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | ||
| Imaging Workbench 2 | Axon Instruments | ||
| Leptomycin B | Sigma | L2913 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE | |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
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