تقييم التعقيد الجذعي الحصين في الفئران المسنين باستخدام طريقة جولجي-كوكس
Summary
هنا نقدم بروتوكول جولجي-كوكس في التفاصيل واسعة النطاق. هذا الأسلوب موثوقة وصمة عار النسيج يسمح لتقييم ذات جودة عالية من الهندسة المعمارية الخلوية في الحصين، وفي جميع أنحاء الدماغ بأكمله، مع الحد الأدنى من استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Abstract
الشواك العمود الفقري هي النتوءات من مهاوي العصبية الجذعية التي تحتوي على نقاط الاشتباك العصبي الإثارة. الاختلافات المورفولوجية والمتفرعة من التشعبات العصبية داخل الحصين متورطة في الإدراك وتكوين الذاكرة. هناك العديد من النهج لتلطيخ غولجي، وكلها كانت مفيدة لتحديد الخصائص المورفولوجية من الشجيرات أربورس وإنتاج خلفية واضحة. وقد تم تصميم طريقة جولجي-كوكس الحالية، (تباين طفيف للبروتوكول الذي يتم توفيره مع مجموعة تلطيخ غولجي التجارية)، لتقييم كيفية جرعة منخفضة نسبيا من العلاج الكيميائي 5-فلوروراسيل (5 فو) سوف تؤثر على التشكل التغصني ، وعدد من العمود الفقري، وتعقيد الشجرة داخل الحصين. 5-فو شكلت بشكل كبير التعقيد شجيري وانخفاض كثافة العمود الفقري في جميع أنحاء الحصين بطريقة محددة المنطقة. وتظهر البيانات المقدمة أن طريقة تلطيخ جولجي إفملطخة بشكل فعال الخلايا العصبية الناضجة في CA1، CA3، والتلفيف المسنن (دغ) من الحصين. هذا البروتوكول تقارير تفاصيل لكل خطوة بحيث يمكن للباحثين الآخرين يمكن وصمة عار موثوق الأنسجة في جميع أنحاء الدماغ مع نتائج ذات جودة عالية والحد الأدنى من استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Introduction
التشعبات هي أكبر جزء من الخلايا العصبية التي تتلقى ومعالجة المدخلات بريسينابتيك 1 . العمليات التشنجي لها هندسة معقدة، حيث فروع القريبة لديها أكبر قطرها من الفروع البعيدة. كما تتطور التشعبات، فإنها تشكل العديد من الاتصالات مع الخلايا العصبية الأخرى في عملية يشار إليها باسم أربوريزاتيون شجيري. مدى ونمط هذا المتفرعة يحدد كمية المدخلات متشابك أن دندريت يمكن معالجة كافية 2 .
تشنج شجيري هو عملية ضرورية للالمعتمد على النشاط اللدونة والتنمية السليمة للدوائر العصبية. التمديد، التراجع، المتفرعة، و سينابتوجينيسيس هي العمليات المعقدة التي تشمل البرامج الوراثية الجوهرية والتأثيرات من العوامل الخارجية. الاختلافات المورفولوجية والمتفرعة من التشعبات العصبية داخل الحصين متورطة في الإدراك وتشكيل الذاكرةf "> 3 ، 4. ترتبط التغيرات في التعقيد شجيري مع التغيرات الفيزيولوجية المرضية والسلوكية 5. تشوهات ترتبط عدة حالات المرض، بما في ذلك متلازمة X الهشة ومتلازمة داون 6 .
الشواك العمود الفقري هي المقصورات تحت الخلوية المتخصصة من أربورس المتغصنة التي تتلقى مدخلات مثيرة داخل الجهاز العصبي المركزي. هناك ثلاث فئات مورفولوجية من العمود الفقري شجيري، مع اسم كل فئة على أساس حجمها وشكلها: 1) الفطر العمود الفقري، والتي لديها الكثافات بوستسينابتيك معقدة مع المزيد من مستقبلات الغلوتامات من غيرها من العمود الفقري 7 ؛ 2) العمود الفقري ستبي، التي تفتقر إلى الجذعية. و 3) العمود الفقري رقيقة، والتي تتكون من الجذعية الضيقة المطولة ورأس كروي 8 . يتم استخدام حجم العمود الفقري شجيري جزئيا لتعريفها، مع العمود الفقري رقيقة عموما أصغر (0.01 ميكرون 3 </sup>) مقارنة مع أشواك الفطر (0.8 ميكرون 3 ) 9 ، 10 . يستقر العمود الفقري مع النضج. على سبيل المثال، فإن العمود الفقري الرقيق إما يتراجع بعد بضعة أيام أو يتطور إلى أشواك الفطر. بدلا من ذلك، فإن العمود الفقري الفطر مستقرة نسبيا ويمكن البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة.ويعتقد أن قوة الاتصالات العصبية أن تستند إلى عدد من العمود الفقري و / أو حجمها 11 ، 12 ، 13 .
الأسلوب الكلاسيكي غولجي تلطيخ والاختلافات أكثر حداثة كانت كلها مفيدة لدراسة التشكل العمود الفقري شجيري والكثافة. جانب واحد فريد من تلطيخ غولجي هو أنه البقع عشوائيا حوالي 5٪ من مجموع الخلايا العصبية، والذي يسمح لتعقب الخلايا العصبية الفردية 14 ، 15 . على الرغم من أن الآلية الدقيقة التي ميلي جولجيبقع أود الخلايا العصبية الفردية لا تزال غير معروفة، ويستند مبدأ الأسلوب على تبلور كرومات الفضة (أغ 2 كرو 4 ) 16 ، 17 . هناك ثلاثة أنواع رئيسية من أسلوب جولجي: غولجي السريع، و غولجي-كوكس، و غولجي-كوبش 18 ، 19 . تبدأ جميع الطرق الثلاث مع مرحلة الحضانة الأولية في أملاح الكروم لعدة أيام إلى أشهر، ولكن هناك بعض الاختلافات الرئيسية بينهما. يستخدم جولجي السريع رباعي أكسيد الأوسيميوم في الخطوة الأولى، في حين أن غولجي-كوبش يتضمن بارافورمالدهيد. تلطيخ في كل من غولجي السريع و غولجي-كوبش تليها حضانة في محلول نترات الفضة 1-2٪ لمدة 7 أيام. طريقة جولجي-كوكس تستخدم كلوريد الزئبق وديكرومات البوتاسيوم بدلا من نترات الفضة ولها وقت تشريب 2-4 أسابيع. ثم يتم تقسيم الأنسجة وسرعان ما وضعت في الأمونيا المخففةالحل، تليها المثبت الفوتوغرافي لإزالة الأملاح. من بين ثلاثة أنواع، ويعتقد أن طريقة جولجي كوكس أن يكون أفضل في تلطيخ الشجيرات المتغصنة دون الكثير من التدخل الخلفية، في جزء منه، لأن التحف الكريستال لا تحدث على سطح الأنسجة (على عكس الطريقة غولجي السريع) 17 ، 20 ، 21 .
الطريقة الحالية هي تباين طفيف للبروتوكول المقدم مع مجموعة تلطيخ غولجي التجارية، وتم تصميمه لتقييم كيفية جرعة منخفضة نسبيا من 5 فو تؤثر على الخصائص المورفولوجية شجيري وكثافة العمود الفقري. أي بيانات تم الحصول عليها يمكن أن توفر المزيد من التبصر في كيفية العلاج العلاج الكيميائي يؤثر على الدوائر العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالمقارنة مع التقنيات الحديثة، فإن طريقة غولجي-كوكس لها العديد من المزايا التي تجعلها الطريقة المفضلة لدراسة مورفولوجيا العمود الفقري: 1) يمكن استخدام التلطيخ أساسا لأي نسيج، 2) إعداد المجهر الضوئي الأساسي هو كل ما هو مطلوب الحصول على الصور المستندة إلى جولجي، 3) التص…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل منحة تجريبية تحت المعاهد الوطنية للصحة P20 GM109005 (أرا) ومركز مركز العلوم العصبية متعدية إيدا جائزة P30 GM110702.
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
Riferimenti
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscienze. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the “selectivity” of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The “single” section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- . Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123 Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000)
- . . Neurolucida 11.03. , (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscienze. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscienze. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
