Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode
Summary
Hier presenteren we een Golgi-Cox protocol in uitgebreid detail. Deze betrouwbare weefselvlekmethode zorgt voor een hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus, en door de hele hersenen, met minimale probleemoplossing.
Abstract
Dendritische stekels zijn de uitsteeksels van de neuronale dendritische assen die excitatoire synaptes bevatten. De morfologische en vertakkingsvariaties van de neuronale dendriten binnen de hippocampus zijn betrokken bij cognitie en geheugenvorming. Er zijn verschillende benaderingen voor Golgi-kleuring, die allemaal nuttig zijn om de morfologische kenmerken van dendritische arbors te bepalen en een heldere achtergrond te geven. De huidige Golgi-Cox methode, (een lichte variatie van het protocol dat wordt geleverd met een commerciële Golgi-kleuringskit) werd ontworpen om te beoordelen hoe een relatief lage dosis van het chemotherapeutische geneesmiddel 5-flurouracil (5-Fu) de dendritische morfologie zou beïnvloeden , Het aantal stekels en de complexiteit van arborisatie binnen de hippocampus. De 5-Fu gemoduleerde de dendritische complexiteit aanzienlijk en verminderde de ruggengraat door de hippocampus op een regio-specifieke manier. Uit de getoonde gegevens blijkt dat de Golgi-kleurmethode efFectively gekleurde de volwassen neuronen in de CA1, de CA3 en de dentate gyrus (DG) van de hippocampus. Dit protocol rapporteert de details voor elke stap, zodat andere onderzoekers het weefsel in de hersenen op betrouwbare wijze kunnen vlek met hoge kwaliteit resultaten en minimale probleemoplossing.
Introduction
Dendrieten zijn het grootste deel van neuronen die presynaptische input 1 ontvangen en verwerken. Hun dendritische processen hebben een complexe geometrie, waarbij de proximale takken een grotere diameter hebben dan de distale takken. Zoals dendrieten ontwikkelen vormen ze verschillende verbindingen met andere neuronen in een proces dat wordt aangeduid als dendritische arborisatie. De omvang en het patroon van deze vertakking bepaalt de hoeveelheid synaptische ingangen die een dendriet adequaat kan verwerken 2 .
Dendritische arborisatie is een noodzakelijk proces voor activiteitafhankelijke plasticiteit en goede ontwikkeling van neuronale circuits. Extensie, terugtrekking, vertakking en synaptogenese zijn ingewikkelde processen die intrinsieke genetische programma's bevatten en invloeden van extrinsieke factoren. De morfologische en vertakkingsvariaties van de neuronale dendriten binnen de hippocampus zijn betrokken bij cognitie en geheugenvormingF "> 3 , 4. De veranderingen in dendritische complexiteit worden geassocieerd met pathofysiologische en gedragsveranderingen 5. Abnormaliteiten zijn gerelateerd aan verschillende ziektetoestanden, waaronder Fragile X Syndrome en Down Syndrome 6 .
Dendritische stekels zijn de gespecialiseerde subcellulaire compartimenten van de dendritische arbors die excitatoire input binnen het centrale zenuwstelsel ontvangen. Er zijn drie morfologische klassen dendritische stekels, met de naam van elke klas op basis van hun grootte en vorm: 1) Paddestoelenwervels, die complexe postsynaptische dichtheden hebben met meer glutamaatreceptoren dan andere stekels 7 ; 2) Stompe stekels, die geen stam hebben; En 3) dunne stekels, die bestaan uit een langwerpige, smalle stam en een bolvormige kop 8 . Het dendritische wervelkolomvolume wordt gedeeltelijk gebruikt om ze te definiëren, met dunne wervelkolven over het algemeen kleiner (0,01 μm 3 </sup>) In vergelijking met paddenstoelen (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . De stekels stabiliseren met rijping. Bijvoorbeeld, de dunne wervels trekken zich na een paar dagen terug of ontwikkelen zich tot paddenstoelen. Als alternatief zijn de paddenstoelen relatief stabiel en kunnen ze gedurende een langere periode overleven. De sterkte van de neuronale verbindingen wordt geacht te zijn gebaseerd op het aantal stekels en / of hun volume 11 , 12 , 13 .
De klassieke Golgi-kleurmethode en zijn modernere variaties zijn allemaal handig om de dendritische ruggengraat morfologie en dichtheid te onderzoeken. Een uniek aspect van de Golgi-kleuring is dat het ongeveer 5% van de totale neuronen willekeurig vlekt, waardoor er sprake is van individuele neuronen 14 , 15 . Hoewel het exacte mechanisme waarin de Golgi methOd vlekken individuele neuronen is nog onbekend, het principe van de methode is gebaseerd op de kristallisatie van zilverchromaat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Er zijn drie hoofdsoorten van de Golgi-methode: de snelle Golgi, de Golgi-Cox en de Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle drie methoden beginnen met een eerste incubatiefase in chroomzouten gedurende meerdere dagen tot maanden, maar er zijn bepaalde belangrijke verschillen tussen hen. De snelle Golgi maakt gebruik van osmiumtetroxide in de eerste stap, terwijl de Golgi-Kopsch paraformaldehyde bevat. De vlek in zowel de snelle Golgi als de Golgi-Kopsch wordt gevolgd door een incubatie in ongeveer 1-2 dagen zilvernitraatoplossing. De methode Golgi-Cox maakt gebruik van mercuric chloride en kalium dichromaat in plaats van zilvernitraat en heeft een impregneringstijd van 2-4 weken. De weefsels worden dan gesneden en snel in een verdunde ammoniak geplaatstOplossing, gevolgd door een fotografische fixer om zouten te verwijderen. Van de drie typen wordt de Golgi-Cox methode gedacht als het beste bij het vlek van de dendritische arbors zonder veel achtergrondinterferentie, onder andere omdat de kristalartefacten niet op het oppervlak van het weefsel voorkomen (anders dan in de snelle Golgi-methode) 17 , 20 , 21 .
De huidige methode is een lichte variatie van het protocol dat wordt geleverd met een commercieel Golgi-kleurset, en is ontworpen om te beoordelen hoe een relatief lage dosis van de 5-Fu de dendritische morfologische eigenschappen en de ruggengraat zou beïnvloeden. Alle verkregen gegevens kunnen verder inzicht geven in de manier waarop chemotherapeutische behandeling de neuronale schakeling beïnvloedt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vergelijking met moderne technieken heeft de Golgi-Cox-methode verschillende voordelen die het de voorkeur geven aan de methode voor het onderzoeken van de ruggengraat morfologie: 1) De kleuring kan voor ieder willekeurig weefsel gebruikt worden. 2) Een basislichtmicroscoopopstelling is alles wat nodig is om Golgi-gebaseerde beelden verkrijgen, 3) De Golgi-Cox beeldvorming is sneller dan confocal beeldvorming, en 4) Golgi-gekleurde afdelingen zijn enkele maanden levensvatbaar tot jaren langer dan monsters die fluores…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een pilot-subsidie onder NIH P20 GM109005 (ARA) en door het Center for Translational Neuroscience IDeA-programma P30 GM110702.
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
Riferimenti
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscienze. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the “selectivity” of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The “single” section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- . Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123 Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000)
- . . Neurolucida 11.03. , (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscienze. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscienze. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
