Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox
Summary
Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.
Abstract
Le spline dendritiche sono le protuberanze degli alberi dendritici neuronali che contengono sinapsi eccitatoriali. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoria. Ci sono diversi approcci alla colorazione Golgi, tutti utili per determinare le caratteristiche morfologiche degli archi dendritici e produrre uno sfondo chiaro. L'attuale metodo Golgi-Cox, (una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione Golgi commerciale), è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del farmaco chemioterapico 5-flurouracil (5-Fu) avrebbe influenzato la morfologia dendritica , Il numero di spine e la complessità dell'arborizzazione all'interno dell'ippocampo. Il 5-Fu ha significativamente modulato la complessità dendritica e ha ridotto la densità della colonna vertebrale in tutto l'ippocampo in un modo specifico della regione. I dati presentati mostrano che il metodo di colorazione Golgi efHa colorato esattamente i neuroni maturi nel CA1, nel CA3 e nel dentato gyrus (DG) dell'ippocampo. Questo protocollo riporta i dettagli di ogni passaggio in modo che altri ricercatori possano affidare affidabilmente il tessuto in tutto il cervello con risultati di alta qualità e minima risoluzione dei problemi.
Introduction
I dendriti sono la parte più grande dei neuroni che ricevono e trattano l'input presinaptico 1 . I loro processi dendritici hanno una geometria complessa, in cui i rami prossimi hanno un diametro maggiore rispetto ai rami distali. Come sviluppano i dendriti, formano diversi collegamenti con altri neuroni in un processo denominato arborizzazione dendritica. L'estensione e il modello di questa ramificazione determina la quantità di input sinaptici che un dendrite può elaborare adeguatamente 2 .
L'arborizzazione dendritica è un processo necessario per la plasticità dipendente dall'attività e lo sviluppo appropriato dei circuiti neuronali. L'estensione, la retrazione, la ramificazione e la sinaptogenesis sono processi intricati che includono programmi genetici intrinseci e influenze da fattori estrinseci. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoriaF "> 3 , 4. Le alterazioni della complessità dendritica sono associate a alterazioni fisiopatologiche e comportamentali 5. Le anomalie sono legate a diversi stati malattie, tra cui la sindrome del X fragile e la sindrome di Down 6 .
Le spine dendritiche sono gli scompartimenti subcellulari specializzati degli archi dendritici che ricevono entità eccitatorie all'interno del sistema nervoso centrale. Ci sono tre classi morfologiche di spine dendritiche, con il nome di ciascuna classe basata sulla loro dimensione e forma: 1) spine di funghi, che hanno densità postinaptica complesse con più recettori di glutammato rispetto alle altre spine 7 ; 2) spine stubby, che non hanno uno stelo; E 3) spine sottili, che sono costituite da uno stelo protratto e stretto e da una testa a globo 8 . Il volume della spina dendritica viene utilizzato in parte per definirli, con spine sottili generalmente più piccole (0.01 μm 3 </sup>) Rispetto alle spine di funghi (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . Le spine si stabilizzano con la maturazione. Ad esempio, le spine sottili ritirarsi dopo pochi giorni o svilupparsi in spine fungine. In alternativa, le spine del fungo sono relativamente stabili e possono sopravvivere per un lungo periodo di tempo. La forza delle connessioni neuronali si basa sul numero di spine e / o sul loro volume 11 , 12 , 13 .
Il classico metodo di colorazione Golgi e le sue variazioni più moderne sono state utili per esaminare la morfologia e la densità della spina dendritica. Un aspetto unico della colorazione Golgi è che macchia casualmente circa il 5% dei neuroni totali, che permette la traccia dei singoli neuroni 14 , 15 . Anche se l'esatto meccanismo in cui il metodo GolgiOd di macchie di singoli neuroni è ancora sconosciuto, il principio del metodo è basato sulla cristallizzazione del cromato d'argento (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Ci sono tre tipi principali del metodo Golgi: il Golgi rapido, il Golgi-Cox e il Golgi-Kopsch 18 , 19 . Tutti e tre i metodi iniziano con una fase iniziale di incubazione nei sali di cromo per diversi giorni a mesi, ma esistono alcune differenze fondamentali tra loro. Il rapido Golgi usa il tetroxido di osmium nel primo passaggio, mentre il Golgi-Kopsch include la paraformaldeide. La colorazione sia nel rapido Golgi che nel Golgi-Kopsch è seguita da un'incubazione in soluzione nitrato d'argento 1-2% per circa 7 giorni. Il metodo Golgi-Cox utilizza il cloruro di mercurio e il bicromato di potassio anziché il nitrato d'argento e ha un tempo di impregnazione di 2-4 settimane. I tessuti vengono quindi sezionati e posizionati rapidamente in una ammoniaca diluitaSoluzione, seguita da un fissatore fotografico per rimuovere sali. Tra i tre tipi, il metodo Golgi-Cox è considerato il più adatto alla colorazione degli archi dendritici senza molte interferenze di fondo, in parte perché gli artefatti cristallini non si verificano sulla superficie del tessuto (a differenza del metodo rapido Golgi) 17 , 20 , 21 .
Il metodo presente è una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione commerciale Golgi ed è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del 5-Fu influenzerebbe le caratteristiche morfologiche dendritiche e la densità della colonna vertebrale. Tutti i dati acquisiti potrebbero fornire ulteriori informazioni sul modo in cui il trattamento chemioterapico influenza la circuiteria neuronale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto alle tecniche più moderne, il metodo Golgi-Cox presenta diversi vantaggi che lo rendono il metodo preferito per esaminare la morfologia della colonna vertebrale: 1) la colorazione può essere utilizzata per qualsiasi tessuto, 2) una messa a punto di microscopi di base è tutto ciò che serve a Acquisire immagini basate su Golgi, 3) l'imaging Golgi-Cox è più veloce di un'immagine confocale e 4) le sezioni macchiate di Golgi sono vitali per diversi mesi a anni più a lungo dei campioni che sono etichet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione pilota sotto NIH P20 GM109005 (ARA) e dal Centro per il Premio Programma IDeA P30 GM110702 per il Trasferimento Neuroscienze.
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
Riferimenti
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscienze. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the “selectivity” of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The “single” section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- . Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123 Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000)
- . . Neurolucida 11.03. , (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscienze. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscienze. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
