Summary
ここでは、白斑Bemisia tabaciからの内胚葉を切開および濾過により単離するためのプロトコールを提示する。増幅後、DNAサンプルは、その後のシークエンシングおよび内寄生虫とコナジラミ間の共生の研究に適している。
Abstract
細菌共生生物は、宿主と親密な関係を形成し、ほとんどの場合宿主に利点を与える。ゲノム情報は、宿主における細菌共生生物の機能および進化を研究するために重要である。ほとんどの共生物質はインビトロで培養できないため、ゲノム配列決定のために適切な量の細菌を単離する方法は非常に重要です。コナジラミBemisia tabaciでは、いくつかの内寄生虫が同定されており、複数のアプローチによる有害生物の発生および生殖において重要であると予測されている。しかし、協会を支える仕組みはほとんど知られていません。この障害は部分的に、白癬菌の内在性物質（ほとんどが細菌細胞に抑制されている）が宿主細胞から分離するのが困難であるという事実に由来する。ここでは、主に解剖学的検査によって白癬B. tabaciからの内在性物質の同定、抽出および精製のための段階的プロトコールを報告するオンにして濾過する。この方法によって調製された内毒素試料は、依然として異なる内毒素種の混合物であるが、その後のゲノム配列決定およびバチルス・タバチにおける内在性の可能な役割の分析に適している。この方法は、他の昆虫から内生菌を単離するためにも使用することができる。
Introduction
節足動物1では 、相対的な宿主と密接な共生関係を形成する細菌が広がっている1 。内分泌攪乱物質は、栄養代謝、繁殖、環境ストレスへの応答2,3、4などのような宿主の局面にほとんど全ての発育段階5において影響を及ぼすことが実証されている5 。しかし、協会の基盤となる仕組みはまだほとんど知られていません。ゲノミクスは、細菌の潜在的な機能と役割を研究する際に重要かつ重要です。いくつかの基本的な情報、 すなわち 、分類学的状態、機能遺伝子、代謝経路、分泌系は、共生している共生生物の潜在的役割についての光を放出するゲノム配列から推測することができる。ハイスループット配列決定の開発により、膨大な数の細菌ゲノムが配列決定されている様々な機能を明らかに6 。
内寄生虫は、アブラムシ7 、ナンキンムシ8 、オオバコ9 、褐斑病10および蝉11などの半翅類において極めて重要である。例えば、アブラムシのBuchneraは、必須の共生生物として、アブラムシのゲノム12由来の遺伝子とともに、必須のアミノ酸生合成に関与することが示されている。さらに、 ブフネラ（Buchnera）の転写調節もまた明らかにされている13 。 オオバコでは、 Carsonellaが配列決定され、今までに発見された最小の細菌ゲノムにランクされている14 。これらの内在性の特徴はすべて、ゲノム配列に基づいて推測されます。これらの内在性物質はインビトロで培養することができないので、seqのために適切な細菌を単離するためにいくつかのアプローチが適用されている覚醒する。アブラムシでは、遠心分離および濾過により内腔菌を抽出し、さらなるゲノムおよび転写分析に供する5 。褐斑病菌では、昆虫ゲノム10全体とともに内生菌が配列決定される10 。
Whitefly B. tabaciは、35種以上の形態学的に区別不能な種（潜在種）を含む種複合体であり、そのうち2種の侵略種が世界中に侵入し、農業生産に多大な害をもたらした15 。注目すべきことに、 B. tabaci種内の内在性物質は、害虫16の発生において重要であることを示している。今日まで、8種の内在性物質が、 ハリネリチア 、 リケッチア 、 アルセノフォヌス 、 カルディニウム 、em> Wolbachia、 FritschaおよびHemipteriphilusは、17,18を定義した。
以前に記載された半体とは異なり、コナジラミB. tabaciはわずか1mmの非常に小さな昆虫である。ほとんどの内在性物質は、バクテリア細胞19 （B細胞において細菌をさらに形成する共生物質を含む特殊細胞）に限定される。さらに、これらの内在性物質はインビトロで培養することができない。バチルス・タバチ（ B. tabaci）から内寄生虫を得るための唯一の方法は、細菌を解剖することである。しかし、解剖が困難である。第一に、脆弱な細菌は、常に分離するのは難しい白蝶の他の組織とつながります。第二に、白蝶の小さなサイズは、十分な細菌の分離を制限する。第3に、内在性細菌は細菌の中に集まり、単一の細菌種を獲得することを非常に複雑にする。
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Protocol
1.白蝶貝の飼育と種識別
- 27±1℃、湿度70±10％、光14時間：暗期10時間の標準条件下で、カゴGossypium hirsutum （Malvaceae）（cv。Zhe-Mian 1973）をカゴで維持する。
- 個々の成熟白コショウを集め、30μLの溶解緩衝液（10mMトリス、pH8.4,50mM KCl、0.45％[wt / vol] Tween-20,0.2％[wt / vol]ゼラチン、0.45％[vol / vol]ノニデットP40,60μg/ mLプロテイナーゼK）。
- ホモジネートを65℃で1時間インキュベートし、次に100℃で10分間インキュベートする。
注：65℃でのインキュベーション時間は必要に応じて増やすことができます。 100℃でのインキュベーション時間は、Proteinase Kを十分に不活性化し、DNA損傷を避けるために厳密に制御する必要があります。 - ミトコンドリアシトクロムオキシダーゼIプライマーに基づいて、whitefly DNA（セクション1.3で得られた）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う。
COI-F：5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R：5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- 1UのTaq DNAポリメラーゼ、10μlのBuffer、0.2mMのdNTP、0.2mMの各プライマー、2μLのwhitefly DNAを含む25μLの最終容量でPCR反応を行います。
- 95℃で3分間の変性後、95℃で45秒間（変性）、50℃で45秒間（アニーリング）および72℃で1分間（伸長）の35サイクル、およびさらなる伸長のために72℃でさらに10分間。
- DNAゲル抽出キットを使用してPCR増幅産物を推奨プロトコールで洗浄します。
- 精製したDNAサンプルをDNAサンプルシークエンシングシステムで、製造者の指示に従って配列決定する。
- Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）を使用してシークエンスの潜在種を特定し、他の種の汚染を避けるために配列を分析するes。
2.内分泌攪乱の同定と局在化
- 白蝶状DNA（ステップ1.3で取得）にPCRを行い、白蝶内の各内毒素の特定の遺伝子を増幅する（PCRレシピはセクション1.4に記載されており、PCR手順およびプライマーは表1に記載されている ）。
- 以前に公表されたプロトコール20 （1％アガロースゲル、ランニングバッファーとしてTris-アセテート-EDTA、電圧5V / cm）に従って増幅した試料をアガロースゲル電気泳動に付して、各細菌の特異的遺伝子を同定する。
- 白い葉の中の細菌種を決定するために、各バンドを回収し、配列決定する（1.5-1.7節参照）。
- 以前に公表されたプロトコール19に従う、内腔の位置を同定するために、ウンシュウの蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を実施する。
注：必要に応じて蛍光プローブの濃度を上げてください。 透過型電子顕微鏡（TEM） - 2.5％[vol / vol]グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）中に白鳥を4時間浸漬して固定する。
- リン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）中でサンプルを3回、毎回15分間洗浄する。
- 1％[wt / vol] OsO 4を含有するリン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）に試料を2時間浸して再度固定する。
- 毎回15分の段階的なエタノール（30％、50％、70％、80％、90％、95％および100％）で試料を脱水する。
- サンプルを100％アセトンに20分間浸して浸します。
- サンプルを100％アセトンと100％Spurr樹脂（1：1）との混合物中に室温で1時間置く。
- 試料を100％アセトンと100％Spurr樹脂（1：3）の混合物に室温で3時間移す。
- サンプルを100％Spurr樹脂（70℃でインキュベート）に9時間以上浸して浸します。
- 白を用いて、マイクロを用いてサンプルを切る私に。
- 絶対ウラニルアセテートに5〜10分間浸漬し、続いて50％アルカリ性クエン酸鉛にさらに5〜10分間浸漬することにより、超薄膜（セクション3.9で得たもの）を染色する。
注：セクション3.1-3.10で利用されている試薬の量は、サンプルによって異なります。サンプルが試薬に浸されていることを確認してください。 - 透過型電子顕微鏡（15,000X）でサンプルを観察し、さらなる使用のために細菌の局在、形状およびサイズを決定する（セクション4.6を参照）。
- 1倍PBS溶液100μLを顕微鏡スライドに加える。綿の葉から3〜4齢のニンフをとり、PBS溶液に浸します。
- 実体顕微鏡下で細かい昆虫の針を使用し、白蝶身からバクテリアを引き出します。
- ゆっくりとニンフの片側の穴を切り、もう一方を少し押してくださいバクテリオミセスを排除するための側面。
- 0.5-10μLピペットで20μLのマイクロローダー（細菌のサイズに合うように先端を切断したもの）をマウントする。個々のバクテリオミウムをPBS溶液からマイクロローダーに抽出する。
- 細菌溶液を洗浄して、細菌溶液をPBS溶液にピペッティングし、細菌を抽出することによって、他の白癬組織の汚染を除去する。 3回繰り返します。
- 直ちに、洗浄した細菌を60μLの1×PBS溶液を含む遠心管にピペットで移す。
- 組み立てたバクテリオロームを5μmのフィルター膜（バクテリアのバクテリアと核の大きさで確認）にシリンジでろ過する。混合液をフィルター膜に完全に移動するために複数回繰り返します。
注：増幅とシークエンシングのより良い結果を得るには、100以上の細菌を集めます。細菌の損失を減らすために1x PBS溶液を使用して最初にフィルター膜をぬらしてください膜に結合する。 - いくつかの改変を加えた推奨プロトコールによるDNA増幅キットを用いて、ろ液（主にコナジラミの内胞子を含む）を増幅する。
- 血液または細胞からのゲノムDNAの増幅の推奨プロトコールを選択し、その後の実験のために緩衝液D2を調製する。
- 1.5μLのろ液（セクション4.6を参照）を遠心チューブに直接添加し、続いて1.5μLのBuffer D2を加えよく混合します。
- 氷上で10分間インキュベートし、停止液1.5μLを加える。
- 15μLの反応バッファーと1μLのDNAポリメラーゼを添加し、穏やかに混合する。
- 混合物を30℃で16時間インキュベートし、続いて65℃で3分間インキュベートする。
- bac用に設計された特異的プライマーを使用することにより、増幅された濾液上で直接PCRを実施する（必要に応じて増幅されたサンプルを希釈する）細菌種を確認するために使用した（2.1節参照）。
- 以前に公表された方法21 （PCRレシピはセクション1.4に記載されている）に従ってwhitefly遺伝子ベータアクチンおよびEF1プライマーを使用することによって宿主ゲノムの汚染があるかどうかを確認するためにPCRを行う。
- 配列の前に増幅されたろ液を分光光度計と蛍光光度計（製造元の指示に従う）に供して、試料の品質および試料が配列決定の基準を満たすかどうかを試験する。
- 増幅したものを製造者の指示に従ってゲノムシーケンサーに供する。
4.白蝶菌の解剖および精製
Endosymbiontゲノムの増幅
6.エンドサイトーシスメタゲノム配列決定
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Representative Results
ここでは、 B. tabaci複合体の中東アジアマイナー1（MEAM1）種を例として取り上げた。コナジラミを飼育するためのコットンおよびコナジラミのいくつかの発生段階を、 図1に示す。コットン植物、成虫コナジラミ、およびコナジラミの第1、 第 2 および第 4齢の幼虫（第3齢の幼虫は第 4齢の幼虫と同様に見える）。第4齢の幼虫は、第1齢および第2齢の幼虫よりも大きいことは明らかであった（ 図1 ）。 MEAM1内のPortieraおよびHamiltonellaの FISH分析を図2に示す。これらの2つの内在性物質はコナジラミの細菌細胞に限定され、2つの細菌の重複もまた観察される。 図3は、 ポンシエラがその細胞壁を失う可能性があることを示す、白コブのポルシエラ内腔の顕微鏡写真 。
配列決定のために、2つのライブラリーが構築され、挿入サイズはそれぞれ200bpおよび2,000bpであった。配列決定後、2つのライブラリーはそれぞれ1,626Mbおよび1,302Mbの生データを生成した。アダプターおよび複製の汚染データをクリーンアップした後、1,484Mbおよび1,219Mbのクリーンデータを取得しました。このアセンブリは、義務共生体、 Portieraの完全なゲノム配列を首尾よくもたらした。さらに、 Hamiltonellaのゲノムドラフトも得られた。 200bpおよび2,000bpの両方のライブラリーに基づくアセンブリは、138個のコンティグを生じた。ペアエンドの関係によれば、138個のコンティグをさらに89個の足場に組み立てた（ 表2 ）。
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図1：この論文で使用されている植物昆虫システムの概要。 （ A ）ワタリはワタ植物（ Gossypium hirsutum cv。Zhe -Mian 1793）上で飼育される。 （ B ）成虫白癬の眺め。 （ C ）ヒラメのライフサイクルにおける幼虫のいくつかの発生段階。赤い矢印は白い卵の卵を指す。黒い矢印は白鳥の1齢のニンフを指す。白い矢印は白鳥の第 2ニンフを指す。青い矢印は白鳥の第四齢のニンフを指す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2： Portiera 、 Hamの魚類分析MEAM1の4 番目のInstar Nymphのミトセラ。 Cy3に結合した Portiera特異的プローブ（赤色）、Cy5でマークしたHamiltonella特異的プローブ（緑色）を使用した。スケールバー=100μm。 （ A ）赤色のハイブリダイゼーションシグナルは、 暗闇の下でのPortieraを表す 。 （ B ）緑色ハイブリダイゼーションシグナルは、 暗視野下のHamiltonellaを表す 。 （ C ） PortieraとHamiltonellaは暗い場の下で信号を合併した。 （ D ） PortieraとHamiltonellaは明視野の下で信号を合併した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：透過電子顕微鏡scopy WhiteflyのPortieraのイメージ矢印はPortieraの位置を示します。スケールバー=1μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| ターゲットシンビオット | 標的遺伝子 | プライマー配列（5'-3 '） | PCR手順 | 参考文献 | ||
| ポルティエラ | 16S rRNA | Por-F：TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95℃1分、60℃1分、72℃1分、5サイクル; | 27 | ||
| Por-R：AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576℃; C 1分、58℃1分、72℃1分、30サイクル; | |||||
| 72℃20分 | ||||||
| Hamiltonella | 16S rRNA | Ham-F：TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95℃1分、60℃1分、72℃1分、5サイクル; | 27 | ||
| Ham-R：CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95℃1分、58℃1分、72℃1分、30サイクル; | |||||
| 72℃20分 | ||||||
| リケッチア | 16S rRNA | Ric-F：GCTCAGAACGAACGCTATC | 95℃2分; | 24 | ||
| Ric-R：GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92℃1分、58度C 1分、72℃90秒、30サイクル; | |||||
| 72℃5分 | ||||||
| アルセノフォヌス | 23S rRNA | Ars-F：CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95℃5分; | 28 | ||
| Ars-R：GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95℃30秒、60.5℃30秒、72℃45秒、30サイクル; | |||||
| 72℃10分 | ||||||
| カーディニウム | 16S rRNA | Car-F：TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95℃2分 | 29 | ||
| Car-R：GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92℃1分、57℃1分、72℃90秒、30サイクル; | |||||
| 72℃5分 | ||||||
| ウォルバキア | 16S rRNA | Wol-F：TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94℃5分; | 30日、31日 | ||
| Wol-R：GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94℃1分、55℃1分、72℃1分、35サイクル | |||||
| Fritschea | 23S rRNA | 金F：GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95℃5分; | 32 | ||
| 金：R：TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94℃1分、64℃1分、72℃90秒、35サイクル; | |||||
| 72℃5分 | ||||||
| 半翅目 | グルエル | OR-溝-F：CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94℃で3分; | 18 | ||
| OR- groEL -R：TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94℃30秒、52℃30秒、72℃2分、34サイクル; | |||||
| 72℃10分 | ||||||
表1：WhiteflyにおけるEndosymbiontsのPCRプライマーおよび手順。
| ポルティエラ | Hamiltonella | |
| コンティグ番号 | 1 | 138 |
| 足場番号a | 1 | 89 |
| 全長、bp | 358,232 | 1,711,449 |
| N50、bp | / | 118,802 |
| N90、bp | / | 16,753 |
| 最大長、bp | / | 390,511 |
| 最小長さ、bp | / | 503 |
| GC含量、％ | 26.18 | 39.89 |
| 以下に示す情報は足場に基づいています。 | ||
表2： Portiera および Hamiltonella ドラフトゲノムの 一般的特徴 。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究の財政的支援は、国家主要研究開発計画（2016YFC1200601）と中国国立自然科学財団（31390421）によって提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
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