Summary
여기, 우리는 해부 및 여과를 통해 흰 반점 Bemisia tabaci 에서 endosymbionts를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 증폭 후, DNA 샘플은 endosymbionts와 whitefly 사이의 mutualism의 후속 시퀀싱 및 연구에 적합합니다.
Abstract
박테리아 공동체는 그들의 숙주와 친밀한 관계를 형성하고 대부분의 경우 숙주에게 이점을줍니다. 유전체 정보는 숙주에서 세균 공생체의 기능과 진화를 연구하는 데 중요합니다. 대부분의 공생 균 은 시험 관내 에서 배양 될 수 없으므로, 게놈 시퀀싱을위한 박테리아의 적절한 양을 분리하는 방법은 매우 중요합니다. 흰 반점 Bemisia tabaci 에서 여러 가지 내인성이 확인되었고 여러 가지 접근법을 통해 해충의 발생과 번식에 중요 할 것으로 예측됩니다. 그러나 협회를 뒷받침하는 메커니즘은 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 장애물은 부분적으로 세균 증식 억제 물질 인 흰가루병에있는 내막 곰팡이가 숙주 세포에서 분리되기 어렵다는 사실에서 기인합니다. 여기에서 우리는 주로 해면체 B. tabaci 에서 endosymbionts의 동정, 추출 및 정제를위한 단계별 프로토콜을보고한다 .켜고 여과하십시오. 다른 endosymbiont 종의 혼합물이긴하지만,이 방법에 의해 준비된 endosymbiont 샘플은 B. tabaci 에서 endosymbionts의 가능한 역할의 후속 게놈 시퀀싱 및 분석에 적합합니다. 이 방법은 다른 곤충에서 내재물을 분리하는 데 사용될 수도 있습니다.
Introduction
상대적 숙주와 친밀한 공생 관계를 형성하는 박테리아는 절지 동물에서 널리 퍼져있다 1 . endosymbionts는 거의 모든 발달 단계 5 에서 영양 대사, 번식, 환경 스트레스에 대한 반응 2 , 3 , 4 등과 같은 숙주의 양상에 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다. 그러나 협회를 뒷받침하는 메커니즘은 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 유전체학은 박테리아의 잠재적 인 기능과 역할을 연구 할 때 우선 순위이며 중요합니다. 분류 학적 상태, 기능 유전자, 대사 경로, 분비 시스템과 같은 몇 가지 기본 정보는 공생에서 공생 공생체의 잠재적 역할에 대한 조명을 밝히는 게놈 서열로부터 추론 할 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱의 개발로 방대한 세균 게놈이 시퀀싱되었습니다여러 가지 기능이 밝혀졌다.
내배체는 진딧물 7 , 벌레 8 , 유문 9 , 갈색 planthoppers 10 및 매미 11 과 같은 반월에서 매우 중요합니다. 예를 들어, 진딧물의 Buchnera 는 필수적인 공생체 로서 진딧물 유전체 12 의 유전자와 함께 필수 아미노산 생합성에 관여하는 것으로 입증되었습니다. 또한 Buchnera의 전사 조절 또한 밝혀졌다. psyllids에서는 Carsonella 가 서열화되어 가장 작은 박테리아 게놈을 14 번 발견했습니다. endosymbionts의 이러한 모든 특징은 게놈 서열을 기반으로하고 유추됩니다. 이러한 endosymbionts가 시험 관내 에서 배양 될 수 없기 때문에, seq에 적합한 박테리아를 분리하기 위해 여러 가지 접근법이 적용되었습니다어젠 싱. 진딧물에서, endosymbionts는 원심 분리 및 여과를 통해 추출하고 추가 게놈 및 transcriptomic 분석 5에 적용 됩니다. 갈색 딱정벌레에서는 곤충 게놈 전체와 함께 내분비물이 서열화됩니다 10 .
Whitefly B. tabaci 는 35 종 이상의 형태 학적으로 구분할 수없는 종 (비밀 종)을 포함하고있는 종 복합체이며, 그 중 2 종의 침입 종이 전 세계에 침입하여 농산물에 막대한 피해를 입혔습니다 15 . 주목할 점은 B. tabaci 종의 내분비는 해충의 발생에 중요성을 보여 주었다. 현재까지, 8 종의 endosymbiont가 흰 반딧불에서 확인되었다. 그 중 하나는 obligent symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum, 7 명의 보조 공생 자인 Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,em> Wolbachia, Fritschea 및 Hemipteriphilus 는 17 , 18을 정의했다.
이전에 기술 된 반 형제와 달리 흰 반점 B. tabaci 는 길이가 1mm에 불과한 매우 작은 벌레입니다. 대부분의 endosymbionts는 bacteriocytes 19 ( B. tabaci 에서 세균을 더 형성하는 symbionts를 포함하는 특수 세포)에 국한되어 있습니다. 또한, 이러한 내재화는 시험 관내에서 배양 할 수 없다. B. tabaci 에서 endosymbionts를 얻는 유일한 방법은 박테리아를 해부하는 것입니다. 그러나 해부학에 어려움이 있습니다. 첫째, 깨지기 쉬운 세균은 흰 반점의 다른 조직과 항상 연결되어 분리되기 어렵습니다. 두 번째로, 흰 반점의 작은 크기는 충분한 박테리아의 고립을 제한합니다. 세 번째로, 세균 내에서 내재물 (endosymbion)이 번식하여 한 종의 세균을 얻기가 매우 복잡합니다.
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Protocol
1. Whitefly 양육과 비밀 종 식별
- 27 ± 1 ° C, 습도 70 ± 10 %, 빛 14 시간 : 어두운 곳에서 10 시간 동안 표준 조건에서 우리 속의 Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973)에 흰 반점 종을 유지한다.
- 개별 성인 흰 반점을 수집하고 30 μl의 용해 버퍼 (10 MM 트리스, pH 8.4, 50 MM KCl, 0.45 % [wt / vol] Tween - 20, 0.2 % [wt / vol] 젤라틴, 0.45 % [vol / vol] Nonidet P 40, 60 g / mL 프로테이나 제 K).
- 65 ° C에서 1 시간 동안 그리고 100 ° C에서 10 분 동안 균질 물을 품어 낸다.
참고 : 필요할 경우 65 ° C에서 배양 시간을 늘릴 수 있습니다. 100 ℃에서의 배양 시간은 Proteinase K를 충분히 비활성화시키고 DNA 손상을 피하기 위해 비판적으로 조절되어야합니다. - 미토콘드리아 시토크롬 옥시 다제 I 프라이머를 기반으로 한 whitefly DNA (1.3 절에서 획득)를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하십시오.
COI-F : 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
COI-R : 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '- 1 U의 Taq DNA 중합 효소, 2.5 μL 10X 버퍼, 0.2 MM dNTP, 각 프라이머의 0.2 MM 및 whitefly DNA의 2 μL를 포함하는 25 μL의 최종 볼륨에서 PCR 반응을 수행하십시오.
- 다음의 PCR 절차 조건을 사용하십시오 : 95 ℃에서 3 분간 변성 후 95 ℃에서 45 초 (변성), 50 ℃에서 45 초 (어닐링) 및 72 ℃에서 1 분간 (연장) 35 사이클 추가 확장을 위해 72 ℃에서 10 분.
- 권장 된 프로토콜로 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 PCR 증폭 제품을 청소하십시오.
- DNA 샘플 시퀀싱 시스템으로 제조사의 지시에 따라 정제 된 DNA 샘플을 시퀀싱합니다.
- BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 시퀀스를 분석하여 가자미 종의 식별 및 다른 특정 종의 오염 방지es.
2. 내분 해 식별 및 지역화
- 흰 둥지 내의 각 endosymbiont의 특정 유전자를 증폭하기 위해 whitefly DNA (1.3 단계에서 얻음)에서 PCR을 수행하십시오 (PCR 처방은 1.4 절에 설명되어 있으며 PCR 절차와 프라이머는 표 1 에 나와 있습니다).
- 이전에 발표 된 프로토콜 20 (1 % 아가로 오스 겔, 실행 버퍼로 트리스 - 아세테이트 - EDTA, 전압 5V / cm)에 따라 증폭 된 샘플을 아가로 오스 겔 전기 영동으로하여 각 세균의 특정 유전자를 확인하십시오.
- 흰 반점 내에서 박테리아 종을 결정하기 위해 각 밴드를 복구하고 순서를 정하십시오 (1.5-1.7 절 참조).
- 이전에 발표 된 프로토콜 19 에 따라 endosymbionts의 위치를 식별하기 위해 whiteflies에 형광 in situ hybridizations (FISH)를 수행하십시오.
참고 : 필요한 경우 형광 탐침의 농도를 높이십시오. 3. 투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy, TEM) - 2.5 % [vol / vol] 글루 타르 알데히드를 함유 한 인산염 완충액 (0.1 M, pH 7.0)에서 흰 반점을 4 시간 동안 담그고 고정시킨다.
- 인산염 완충액 (0.1 M, pH 7.0)에서 시료를 3 회, 매회 15 분 동안 씻으십시오.
- 1 % [wt / vol] OsO 4 를 함유 한 인산염 완충액 (0.1 M, pH 7.0)에 시료를 2 시간 동안 담근다.
- 매번 15 분씩 일련의 에탄올 (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 및 100 %)로 샘플을 탈수하십시오.
- 샘플을 100 % 아세톤에 20 분 동안 담그고 담그십시오.
- 실온에서 1 시간 동안 100 % 아세톤과 100 % Spurr 수지 (1 : 1)의 혼합물에 샘플을 놓습니다.
- 실온에서 3 시간 동안 100 % 아세톤 및 100 % 스퍼 르 수지 (1 : 3)의 혼합물에 샘플을 옮긴다.
- 전달하고 샘플을 100 % Spurr 수지 (70 ° C에서 잠복)에 9 시간 이상 담그십시오.
- 마이크로를 사용하여 흰 반점 샘플 섹션나에게.
- 5 분에서 10 분 동안 절대 우라 닐 아세테이트에 담금으로써 초박막 (섹션 3.9에서 획득)에 얼룩을지게하고, 5 ~ 10 분 동안 50 % 알칼리성 납 시트 레이트에 담그십시오.
참고 : 섹션 3.1-3.10에서 사용 된 시약의 부피는 샘플에 따라 다릅니다. 샘플이 시약에 담겨 있는지 확인하십시오. - 투과 전자 현미경 (15,000X)에서 샘플을 관찰하여 추가로 사용할 박테리아의 위치, 모양 및 크기를 결정합니다 (4.6 절 참조).
- 현미경 슬라이드에 1x PBS 용액 100 μL를 추가합니다. 면화 잎에서 3, 4 th instar nymph를 골라 PBS 용액에 담그십시오.
- 실체 현미경으로 미세 곤충 바늘을 사용하고 흰 반점 몸체에서 세균들을 꺼내십시오.
- 요정의 한쪽에있는 구멍을 부드럽게 자르고, 다른 쪽을 살짝 누릅니다.bacteriomes를 내보내는 쪽.
- 0.5-10 μL 피펫으로 20 μL 마이크로 로더를 장착하십시오 (박테리아의 크기에 맞게 끝 부분을 자릅니다). PBS 용액에서 개별 세균을 추출하여 마이크로 로더에 넣습니다.
- bacteriome을 PBS 용액에 pipetting하고 박테리아를 추출하여 다른 흰 반점 조직의 오염을 제거하십시오. 3 번 반복하십시오.
- 즉시 1x PBS 용액 60 μL가 들어있는 원심 튜브에 세균을 세척합니다.
- 5 μm 필터 멤브레인을 통해 조립 된 박테리아를 주사기로 걸러냅니다 (박테리아의 크기와 흰 반점이있는 박테리아 세포의 핵으로 결정됨). 혼합 된 액체를 필터 멤브레인으로 완전히 이동 시키려면 여러 번 반복하십시오.
참고 : 더 나은 증폭 및 시퀀싱 결과를 얻으려면 100 개가 넘는 박테리아를 조립하십시오. 박테리아의 손실을 줄이기 위해 1x PBS 용액을 사용하여 필터 멤브레인을 먼저 적시십시오.막에 결합. - 일부 수정과 함께 권장 프로토콜에 의해 DNA 증폭 키트를 사용하여 여액 (주로 흰 반점의 endosymbionts을 포함)을 증폭.
- 혈액 또는 세포에서 게놈 DNA의 증폭 프로토콜을 선택하고 이후 실험을 위해 버퍼 D2를 준비하십시오.
- 원심 분리 튜브에 여과 액 1.5 μL (4.6 절 참조)을 직접 넣은 다음 1.5 μL의 Buffer D2를 넣고 잘 섞는다.
- 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션하고 1.5 ㎕의 정지 용액을 첨가한다.
- 반응 완충액 15 μL와 DNA 중합 효소 1 μL를 첨가하고 부드럽게 섞는다.
- 혼합물을 30 ° C에서 16 시간 동안 배양하고, 65 ° C에서 3 분간 교반한다.
- 박테리아를 위해 고안된 특정 프라이머를 사용하여 증폭 된 여과 액에서 PCR을 직접 수행하십시오 (필요한 경우 증폭 된 시료를 희석하십시오).박테리아 종을 확인하기 위해 테리아 (2.1 절 참조).
- 이전에 발표 된 방법 21 (PCR 처방은 1.4 절에서 설명 됨)에 따라 whitefly 유전자 베타 - 액틴 및 EF1 프라이머를 사용하여 숙주 게놈의 오염 여부를 확인하기 위해 PCR을 실시하십시오.
- 샘플의 품질을 테스트하고 시퀀싱을위한 기준을 충족하는지 여부를 확인하기 위해 시퀀싱 전에 증폭 된 여액을 분광 광도계 및 형광 측정기 (제조사의 지침에 따라)에 부탁하십시오.
- 제작사의 지시에 따라 게놈 시퀀서에 증폭시킨다.
4. 흰 파리 박테리아의 해부 및 정제
5. Endosymbiont 게놈의 증폭
6. Endosymbiont Metagenome 시퀀싱
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Representative Results
B. tabaci 단지의 중동 아시아 소아 1 (MEAM1) 종은 여기서 설명을 위해 예로 취했다. 흰가루병을 키우기위한 면화와 흰가루병의 여러 발달 단계가 면화 식물, 성충과 흰빛 반딧불이의 1 , 2, 4 번 족장 약충을 포함하여 그림 1에 나와 있습니다 (3 번 황충은 4 번 황후 요정과 유사하게 보입니다. ). 4 th instar 님프가 1 번째 및 2 번째 instar nymphs보다 더 컸음이 분명했습니다 ( 그림 1 ). MEAM1 내의 Portiera 와 Hamiltonella 의 FISH 분석은 그림 2 에 나와 있습니다. 이 두 endosymbionts은 흰 반점의 세균 세포에 국한되며 두 박테리아의 중첩도 관찰됩니다. 도 3 은 전송 전자석 흰 반점의 Portiera endosymbiont의 tron 현미경 이미지. Portiera가 세포벽 을 잃을 수도 있음을 나타냅니다 .
시퀀싱을 위해 200bp와 2,000bp의 인서트 크기를 갖는 두 개의 라이브러리가 구축되었습니다. 시퀀싱 후 두 라이브러리는 각각 1,626 Mb 및 1,302 Mb의 원시 데이터를 생성했습니다. 어댑터 및 중복에 대한 오염 데이터를 정리 한 후 1,484 Mb 및 1,219 Mb의 깨끗한 데이터를 수집했습니다. 어셈블리는 절대 공동체 인 Portiera의 완전한 게놈 시퀀스를 성공적으로 만들어 냈습니다 . 또한, Hamiltonella 의 초안 게놈 ( genomeome) 도 얻어졌다. 200 bp와 2,000 bp 라이브러리 모두를 기반으로 한 어셈블리는 138 개의 콘 티그를 생성했습니다. 양측의 관계에 따르면, 138 개의 콘티그는 89 개의 비계로 조립되었다 ( 표 2 ).
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그림 1 :이 종이에서 사용 된 식물 곤충 시스템의 개요. ( A ) 백발은면 식물 ( Gossypium hirsutum cv. Zhe-Mian 1793)에서 사육된다. ( B ) 성인 whitefly의보기. ( C ) 흰가루 생활주기에있는 instar 요정의 여러 발달 단계. 빨간색 화살표는 가자미의 알을 가리 킵니다. 검은 색 화살표는 흰 둥지의 1 st instar 요정을 가리 킵니다; 백색 화살표는 흰 반점의 제 2 요정을 가리 킵니다; 파란색 화살표는 흰 둥지의 4 번째 첩자 요정을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 2 : Portiera , 햄 의 물고기 분석MEAM1의 4 번째 Instar 님프에서 iltonella. Cy3에 접합 된 Portiera 특이 적 프로브 (적색), Cy5로 표시된 Hamiltonella 특이 적 프로브 (녹색)를 사용 하였다. 스케일 바 = 100 μm. ( A ) 적색 혼성화 신호는 암시장 아래의 Portiera를 나타낸다 . ( B ) 녹색 하이브리드 화 신호는 어두운 영역에서 Hamiltonella를 나타낸다 . ( C ) Portiera 와 Hamiltonella는 암시장에서 신호를 병합했다. ( D ) Portiera 와 Hamiltonella 는 밝은 영역에서 신호를 병합했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 전송 전자 마이크로scopy Whitefly의 Portiera 이미지입니다. 화살표는 Portiera의 위치를 나타냅니다 . 눈금 막대 = 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 대상 공생 | 표적 유전자 | 프라이머 서열 (5'-3 ') | PCR 절차 | 참고 문헌 | ||
| 포르 티에라 | 16S rRNA | Por-F : TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95 ° C 1 분, 60 ° C 1 분, 72 ° C 1 분, 5 사이클; | 27 | ||
| Por-R : AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576 ℃, C1 분, 58 ℃, 1 분, 72 ℃, 1 분, 30 사이클; | |||||
| 72 ℃ 20 분 | ||||||
| Hamiltonella | 16S rRNA | 함 -여 : TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95 ° C 1 분, 60 ° C 1 분, 72 ° C 1 분, 5 사이클; | 27 | ||
| 함 - R : CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95 ℃ 1 분, 58 ℃ 1 분, 72 ℃ 1 분, 30 사이클; | |||||
| 72 ℃ 20 분 | ||||||
| 리케차 | 16S rRNA | Ric-F : GCTCAGAACGAACGCTATC | 95 ℃ 2 분; | 24 | ||
| Ric-R : GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92 ° C 1 분, 58 °C 1 분, 72 ℃ 90 초, 30 사이클; | |||||
| 72 ℃ 5 분 | ||||||
| Arsenophonus | 23S rRNA | Ars-F : CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95 ℃ 5 분; | 28 | ||
| Ars-R : GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95 ℃ 30 초, 60.5 ℃ 30 초, 72 ℃ 45 초, 30 사이클; | |||||
| 72 ℃ 10 분 | ||||||
| 카디 늄 | 16S rRNA | 자동차 -F : TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95 ℃ 2 분 | 29 | ||
| 자동차 -R : GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92 ℃ 1 분, 57 ℃ 1 분, 72 ℃ 90 초, 30 사이클; | |||||
| 72 ℃ 5 분 | ||||||
| 울바 치아 | 16S rRNA | Wol-F : TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94 ℃ 5 분; | 30, 31 | ||
| Wol-R : GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94 ° C 1 분, 55 ° C 1 분, 72 ° C 1 분, 35 사이클 | |||||
| Fritschea | 23S rRNA | 금 - F : GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95 ℃ 5 분; | 32 | ||
| 금 -R : TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94 ℃ 1 분, 64 ℃ 1 분, 72 ℃ 90 초, 35 사이클; | |||||
| 72 ℃ 5 분 | ||||||
| 반상회 | 그로 엘 | 직사각형 - F : CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94 ℃ 3 분; | 18 | ||
| OR 그루브 -R : TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94 ℃ 30 초, 52 ℃ 30 초, 72 ℃ 2 분, 34 사이클; | |||||
| 72 ℃ 10 분 | ||||||
표 1 : 흰가루비의 Endosymbionts의 PCR 프라이머 및 절차.
| 포르 티에라 | Hamiltonella | |
| 콘티 그 번호 | 1 | 138 |
| 발판 번호 a | 1 | 89 |
| 총 길이, bp | 358,232 | 1,711,449 |
| N50, bp | / | 118,802 |
| N90, bp | / | 16,753 |
| 최대 길이, bp | / | 390,511 |
| 최소 길이, bp | / | 503 |
| GC 함량, % | 26.18 | 39.89 |
| 아래 제시된 정보는 모두 발판을 기반으로합니다. | ||
표 2 : Portiera 및 Hamiltonella Draft Genome 의 일반적인 특징 .
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구에 대한 재정 지원은 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램 (2016YFC1200601)과 중국 국립 자연 과학 재단 (31390421)에 의해 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
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