Den Murine cholin-mangelfuld, Ethionine-suppleret (CVU) kost Model af kronisk leverskade
Summary
Her beskriver vi en fælles metode for at fremkalde kronisk leverskade i mus ved fodring med en cholin-mangelfuld og ethionine-suppleret (CVU) kost. Vi demonstrere sundhedsovervågning, leveren perfusion, isolation og bevarelse. Et tidsforløb af seks uger kan informere om leverskade, pathohistology, fibrose, inflammatoriske, og leveren stamfader celle svar.
Abstract
Kroniske leversygdomme, viral hepatitis, alkoholisk leversygdom, eller ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, er karakteriseret ved stadige betændelse, fremadskridende ødelæggelse og regenerering af hepatisk parenkym, leveren stamfader celle spredning, og fibrose. Slutstadiet af hver kronisk leversygdom er skrumpelever, en stor risikofaktor for udvikling af hepatocellulært carcinom. For at studere processer regulerer sygdom indledning, etablering og progression, bruges flere dyremodeller i laboratorier. Her beskriver vi en seks-ugers tid kursus af cholin-mangelfuld og ethionine-suppleret (CVU) musemodel, som indebærer fodring seks uger gamle mandlige C57BL/6J mus med cholin-mangelfuld chow og 0,15% DL-ethionine-suppleret drikkevand. Overvågning af dyrs sundhed og en typisk organ vægt tab kurve er forklaret. Protokollen viser brutto undersøgelse af en CVU-behandlede lever og blod samling af cardiac punktering for efterfølgende serum analyser. Næste, leveren perfusion teknik og samling af forskellige hepatiske lapper for standard evalueringer er vist, herunder lever histologi vurderinger af hæmatoxylin og eosin eller Sirius rød stainings, immunfluorescent påvisning af hepatisk cellepopulationer samt transkriptom profilering af den lever mikromiljø. Denne musemodel er velegnet til at studere inflammatoriske, fibrogenic og leveren stamfader celle dynamics induceret gennem kronisk leversygdom og kan bruges til at teste potentielle terapeutiske agenter, der kan modulere disse processer.
Introduction
Leveren er den største kirtel metaboliske organ i kroppen og har mange komplekse funktioner. Centrale roller for leveren omfatter fordøjelse, stofskifte, afgiftning, opbevaring af essentielle næringsstoffer, fremstilling af blodplasma proteinkomponenter og immunitet medieret gennem bosiddende makrofager eller Kupffer celler. Leveren har en fantastisk evne til at regenerere selvom op til 70-90% af dens samlede masse er tabt. I tilfælde af akut leverskade, sådan som det ses efter en delvis hepatectomy eller acetaminophen forgiftning, formere de resterende sunde hepatocytter for at reparere skaderne i en meget koordineret proces1. Men når hepatocytter er kronisk skadet på grund af langsigtet viral infektion, alkoholisk eller ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, den inflammatoriske mikromiljø udløser aktivering af fibrose-kørsel hepatisk Stjernehus celler og den spredning af leveren stamceller (LPCs) med potentiale til at differentiere i enten cholangiocytes eller hepatocytter2,3,4,5. Den præcise oprindelse, differentiering skæbne af LPCs, deres bidrag til leveren regenerering og hepatocarcinogenesis har været emner for en intens debat og sandsynligvis afhænger kvæstelsernes og sammenhæng2. Rækkefølgen af tidlige regenerering-associerede begivenheder diskuteres også kontroversielt, med nogle efterforskere, hvorefter hepatisk Stjernehus celle aktivering og matrix remodellering er afgørende for generation af en LPC-favorisere niche6, mens andre betænkningen at LPC udvidelse og den såkaldte kanalsystem reaktion er forpligtet til at udløse fibrogenesis7. Der er adskillige dyremodeller for at undersøge specifikke aspekter af skade og regenerering, i et forsøg på at forstå alle de underliggende faktorer, der regulerer sygdomsprogression og i sidste ende udvikle nye behandling strategier for patienter8.
Cholin-mangelfuld og ethionine-suppleret (CVU) kosten modellen blev oprindeligt udviklet til brug i rotter og senere ændret til kronisk leverskade induktion i mus9,10. Kosten mangel af cholin resulterer i nedsat forsamling og sekretion af meget low-density lipoprotein. Kombineret med hepatocarcinogen DL-ethionine, dette regime fører til overdreven hepatisk fedt lastning, kontinuerlig inflammation, periportal fibrose, LPC svar og langsigtede hepatocellulært carcinom udvikling11,12 . Men vigtigere, forskellige mus stammer udviser karakteristiske mønstre af inflammatoriske, fibrogenic og LPC svar dynamics13. Denne protokol beskriver kronisk leverskade induktion i C57BL/6J mus, de mest almindeligt anvendte indavlede mus stamme.
I kronisk leversygdom forskning omfatter typiske analyser histologiske vurderinger af hæmatoxylin og eosin samt Sirius rød farvning for at visualisere kollagen depositioner, immunhistokemisk eller immunfluorescent påvisning af hepatisk cellepopulationer, transkriptom analyse af den lever mikromiljø, der orchestrates de inducerede cellulære ændringer gennem komplekse vækstfaktor og cytokin netværk14,15,16,17 , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kronisk leversygdom er ofte en tavs sygdom med de fleste patienter bliver symptomfrie og det er en af de største bidragydere til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Kronisk alkoholisme og hepatitis C virusinfektion er de førende årsager. Kronisk leverskader er karakteriseret ved nedsat inflammation, fibrose og i svære tilfælde skrumpelever, karcinom og i sidste ende leversvigt. Der er i øjeblikket ingen kur, og selv om store EU-fremskridt har gjort at forstå mekanismerne af leversygdom, nye terapeutiske mul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) i Australien (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Forfatterne vil gerne takke Curtin sundhed Innovation Research Institute medarbejdere for teknisk bistand.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration – mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
