Summary
ここで我々 はコリン欠乏とエチオニン (CDE) の食事療法の供給によって慢性肝障害モデルマウスを誘導する一般的な方法をについて説明します。正常性の監視、肝灌流、分離、および保存を示します。6 週間の経過は肝障害、pathohistology、炎症、線維化、肝前駆細胞の応答について知らせることができます。
Abstract
ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患などの慢性肝疾患は肝実質, 肝前駆細胞の再生、進歩的な破壊継続的な炎症によって特徴付けられる増殖、および線維化。あらゆる慢性肝疾患の末期、肝硬変、肝細胞癌の開発のための主要な危険因子です。病気の発生・進行を調節するプロセスを研究所でいくつかの動物モデルを使用します。ここでコリン欠乏/エチオニン (CDE) マウス モデルのコリン欠乏チョウと 0.15 %dl エチオニン飲む水で 6 週間の古い男性 c57bl/6 j マウスを餌を含む 6 週間経過について述べる。動物の健康と体の典型的な重量損失曲線の監視、説明します。プロトコルは、その後血清分析用心臓穿刺によって CDE 治療肝臓と血液コレクションの総検査を示します。次に、肝灌流法と標準的な評価のための異なる肝葉のコレクション、ヘマトキシリンとエオシンまたはシリウス赤染色、肝細胞の蛍光検出による表示などの肝組織評価トランスクリプトームの肝の微小環境のプロファイル。このモデルマウスは、炎症性を勉強して、線維形成性、および肝前駆細胞ダイナミクスにより誘起された慢性肝疾患とこれらのプロセスを調節することができる潜在的な治療上のエージェントをテストするために適しています。
Introduction
肝臓は体の最大の腺代謝器官で、多くの複雑な機能。肝臓の重要な役割は、消化、代謝、解毒、ストレージ必須栄養素の血血しょう蛋白質成分とクッパー細胞やマクロファージを介した免疫の生産に含まれます。肝臓はその総質量の 70-90% までが失われた場合でもを再生する偉大な能力。急性の肝障害が発生した場合切除またはアセトアミノフェン中毒、次見られるような残りの健康な肝細胞は非常に調整されたプロセス1の損傷を修復する増殖します。しかし、肝細胞が慢性的な長期的なウイルス感染、アルコールや非アルコール性脂肪肝疾患、負傷炎症性微小環境トリガー線維症運転肝星細胞の活性化と、胆管や肝細胞2,3,4,5に分化する可能性を秘めた肝前駆細胞 (Lpc) の増殖。正確な起源 Lpc、肝再生と肝発癌への貢献の分化運命は激しい議論のトピックをされているし、ほとんど損傷重症度およびコンテキスト2によって異なります。早期再生関連のイベントの順序はまた論争的に論議、肝星細胞の活性化と行列を改造が LPC を好むニッチ6、他の世代のために不可欠であるといういくつかの捜査でレポートは、LPC 拡張といわゆる管状反応がトリガー維7に必要。病気の進行を調節するすべての根本的な要因を理解し、最終的に患者の8のための新しい処置の作戦を開発する試みの傷害と再生の特定の側面を研究する多くの動物モデルがあります。
コリン欠乏とエチオニン (CDE) の食事モデルはもともとラットで使用するため開発され、慢性肝障害マウス9,10誘導後に変更されました。コリンの栄養欠乏は、障害者のアセンブリと非常に低密度リポタンパク質の分泌の結果します。Hepatocarcinogen DL-エチオニンを組み合わせると、この療法はロードすると、継続的な炎症、線維症 periportal、LPC 応答過度の肝脂肪につながるし、長期にわたって肝細胞癌開発11,12.しかし、重要なは、異なるマウス系統展示、炎症性の線維と LPC の独特パターン応答ダイナミクス13。このプロトコルでは、慢性肝障害誘導で最もよく使用される c57bl/6 j マウス近交系マウスの緊張について説明します。
慢性の肝臓病の研究で典型的な分析を含めるヘマトキシリンとエオシンとシリウス赤染色コラーゲン沈着、免疫組織化学的、または肝細胞の蛍光検出による組織学的評価複雑な成長因子とサイトカイン ネットワーク14,15,16,17を介して誘導される携帯電話の変更を調整する肝の微小環境のトランスクリプトーム解析,18。
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Protocol
1 です動物実験
カーティン大学動物倫理委員会で承認されたこの調査に記載されているすべての動物実験 (承認番号: AEC_2014_28) の開始前に、。実験し、ケアとの動物の使用のためのオーストラリアのコードに従って実行されます
。- 動物
- 実験のための 6 週間の古い男性 c57bl/6 j マウスを使用します 。
- 実験デザイン
- 次の動物施設に到着後、実験の開始前に 4 日間を慣らすためにネズミを許可します 。 ソフトコーテッドもみ殻寝具、目に見える粒と茎の枯渇されているありで 12 時間昼/夜サイクルにマウスを個別に維持に
- 家のマウスは、ケージを通気します。3 つと、7 日に寝具の変更、毎週その後 。
- コリン欠乏への 自由 アクセスを提供するマウス ダイエットと DL-エチオニンの 0.15% を添加した水を飲む。4 ° C で水を DL エチオニン添加を維持し、新鮮さを保障し、飲酒を奨励する飲料水 1 日おきを交換します。コリン欠乏食事週に 1 回の食事の完全な変化を 1 日おきにトップアップ 。
- 観察マウス安静時および処理中に。全体的な外観、姿勢、社会的相互作用、グルーミング、動物の健康のモニター規格記号状態をコートし、本体重量します 。 20% 以上を展示、動物体の減量を確保するための実験の最初の 2 週間の間に毎日
- 重さマウスは不必要な苦しみを制限する安楽死させた。これは通常動物の 5% 未満の場合です。2 週間後、計量の周波数を 3 倍に減らすことが (例えば 月曜日、水曜日、金曜日) の毎週 。
- 肝灌流および分離
- 腹腔内投与によるケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) (CDE の食事療法 1、2、および 6 週間における) 示された時点でマウスを麻酔します。適切な麻酔を確保するためペダルの逃避反射をテストします 。
- は 70% のエタノールで毛皮をウェットし、マヨはさみを使って横隔膜まで腹部壁の垂直正中切開を行います。胸郭は、中心部に簡単にアクセスを削除できます 。 25 x 1/2 を使用して遅い心臓穿刺によって
- 収集血 " 心の崩壊を避けるために規則的な壁針。血液遠心チューブ 10 分 2,000 × g で遠心分離後、血清サンプルを取得するために室温で凝固を許可します。その後、標準的な手順 12 でアラニン トランスアミナーゼ血清を測定します 。
- は、胃と小腸を側に移動し、門脈を公開します。許可を終了し滅菌リン酸緩衝と肝臓を灌流液を生理食塩水にマヨはさみを使用して心臓をカット (pH 7.4 を =) 27 x 1/2 を使用して門脈を cannulating によって " 規則的な壁針。均等に湯通し肝臓はすべて肝葉の正常な血流を示します 。
- は慎重に肝を外し、鉗子とマヨのはさみを使用してシャーレに配置。過剰、肝臓以外の組織と胆嚢を削除します 。
- 肝臓保全
- 総肝重量が記録されている、いくつかの平方ミリメートルのいくつかの小さな断片に 1 つの小葉をカットした後の生殖不能の管にそれらを転送とスナップ-凍結液体窒素後 rna標準プロトコルに従っての蛋白質の抽出。組織の劣化を防ぐため、オルガン コレクション後できるだけ早くこれらの組織の部分に凍結します 。
- 標準のプロトコルに従って後の処理、パラフィン包埋、10% 中性緩衝ホルマリンで 1 つの葉を収集します 。
- 最適切削温度 cryomatrix 樹脂を埋め込むことでいっぱいとスナップ-凍結液体窒素で金型内に 1 つの葉を配置します 。
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Representative Results
CDE 誘発慢性肝障害の 6 週間の時間にわたって、日 7 (誘導段階)、14 と 21 (確立フェーズ)、42 (メインテナンス) パラメーターを評価しました。コントロール マウスと比較して、CDE 投与マウスは初期適応段階で初期体重の 20% までを失い、設置と保守のフェーズ(図 1)で体重を取り戻すために傾向があります。体重だったに反比例するアラニン トランスアミナーゼ血清肝障害(図 2)のインジケーター。4 マイクロ メートル薄い、ホルマリン固定、パラフィン包埋の肝組織切片ヘマトキシリンとエオシン肝のアーキテクチャを評価するために染色された.健康な肝臓には、肝実質を形成、中心静脈から放射される肝細胞の整然としたコードで通常のアーキテクチャが表示されます。対照的に、CDE 治療肝臓は誘導と確立段階とメインテナンス(図 3)に正規化で大幅に乱れた肝アーキテクチャと多くの好塩基性細胞の実質浸潤を示した。線維化を評価するためにポリ アゾ色素肝コラーゲン沈着を可視化するシリウス赤 4 マイクロ メートル薄い、ホルマリン固定、パラフィン包埋肝切片染色.CDE 誘発慢性肝障害の誘導段階でコラーゲンを periportal 領域柔組織内に蓄積。ただし、レベルを確立および保守段階(図 4)に正規化します。マトリックスに埋め込まれ、スナップ冷凍肝は、クライオスタットの 7 マイクロメータ薄片にカットされました。細胞マーカーの免疫蛍光染色し、時間経過中に肝細胞の特定の人口の時空の配置を分析を行った.健康な肝臓は、CD45 の細胞マーカー検出肝マクロファージまたはクッパー細胞、胆管の構造がのみ染色胆管と肝前駆細胞マーカー panCK。慢性的な負傷の肝臓、胆管と肝前駆細胞の増殖、ピークと CDE 治療の約 14 日後定常状態に達したがただし、反映増加 panCK 染色します。CD45 陽性炎症性細胞、肝臓常駐型と浸潤細胞、また CDE 誘発傷害の誘導段階でピークに達し、ゆっくりとレベルを制御する(の確立と保守のフェーズで正規化を表す数図 5)。この慢性的な負傷した肝臓の炎症性セル人口の拡大は、肝の微小環境の急激な変化を伴っていた。迅速な誘導やサイトカインや成長因子の転写レベルの大幅な増加が観察されました。腫瘍壊死因子 (TNF)、腫瘍壊死因子のような弱い誘導アポトーシス (微調整) リンフォトキシン β (LTβ)、肝細胞増殖因子 (HGF)、例えば成長因子 β (TGFβ)、およびインターロイキン 6 (IL-6) の変換が含まれます。そのトラン スクリプト レベル誘導段階でピークに達したすべて確立および保守段階 - 示した疾患パラメーター (図 6)のように正規化し、。
図 1.体の健康と CDE 扱われるマウスの体重記録します。慢性的な負傷したマウスは CDE 餌の誘導段階で初期体重の 20% までを失い、その後回復しました。代表的な図を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.健康と CDE 扱われるマウス血清中のアラニンのトランスアミナーゼ。アラニン アミノ基転移酵素 (ALT) 血清 6 週間経過時に健康なマウスに変わらずに残ったが、CDE 扱われる動物の確立および保守段階での正規化と誘導段階でピークに達した。代表的な図を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.肝切片ヘマトキシリンとエオシン染色。H に染まっていたホルマリン固定、パラフィン包埋の肝組織切片 & 電子制御マウス肝細胞索の整然とした配置を示した。対照的に、肝臓のアーキテクチャは大幅に正規化を 6 週間コースの終わりの方に、誘導段階で CDE 処理マウスで中断されました。スケール バーを表します 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.健康と CDE 処理マウスでシリウス赤染色促進コラーゲン視覚化します。マイナーな症状コラーゲン沈着にのみ表示されるコントロール マウスと比較して、慢性的な負傷動物コラーゲンの蓄積で示した periportal 実質地域のメンテナンス フェーズに向けてゆっくり正規化と誘導の段階で、6 週間の CDE 時間コース。スケール バーを表します 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.炎症や胆道・肝前駆細胞の蛍光検出します。健康な肝臓の胆管構造のみ染色胆管と肝前駆細胞マーカー panCK (赤) と CD45 抗体は肝臓居住者マクロファージまたはクッパー細胞 (緑) を可視化します。餌、CD45 数 CDE の誘導段階で+肝臓居住者と同様に浸潤炎症細胞を含む細胞が大幅に増加します。この炎症反応は、t の終わりに向かって正規化彼の 6 週間のコースです。胆管と肝前駆細胞染色マーカー panCK 番号 2 週目までに増加し、その後定常状態に達した。DAPI は、核を定量化するために使用されました。スケール バーを表します 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.サイトカインや増殖因子のトランスクリプトーム解析します。RNA が肝の微小環境のトランスクリプトーム解析を実行する CDE 処理肝組織のスナップ固定部分から分離されました。腫瘍壊死因子 (TNF)、アポトーシス (微調整) の TNF のような弱いインデューサの代表図リンホトキシン-ベータ版 (LTβ)、肝細胞増殖因子 (HGF) 成長因子 β (TGFβ)、およびインターロイキン 6 (IL-6) の変換が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
慢性肝疾患は多くの場合ほとんどの患者は無症候性であるが、サイレント病と罹患率と死亡率の世界的な主要な貢献の 1 つです。慢性アルコール依存症、C 型肝炎ウイルス感染の主要な原因。慢性肝障害は肝の炎症によって特徴付けられる線維症と重症肝硬変・癌・最終的に肝不全。利用可能な現在いる治療法はないと主要な進歩は肝疾患のメカニズムを理解するためになされた、新しい治療の道がまだ緊急必要。
CDE 国会は誘導と脂肪や脂肪肝、炎症、線維化、LPC 増殖させ、長期的な実験は、肝細胞癌6 の開発研究のための時間効果的なシンプルな簡単に管理できるモデル ,11,12,13,16,17。ラット19,20で最初に使用された、後で野生型および遺伝子改変マウス9の LPC 研究を容易にするために適応されました。
本研究室では、我々 を他の寝具の選択肢の代わりにライ麦のもみ殻を使用する重要な発見しました。にもかかわらず、それは目に見える粒と茎の枯渇は、いくつかの追加の栄養素はソフトコーテッドもみ殻寝具に残り、CDE 誘発慢性肝障害誘導の過酷な効果の一部を相殺します。さらに、この寝具環境エンリッチメントを提供し、マウスの通常の食品検索行動を奨励します。有害事象の大半 CDE 治療の最初の週に観察・その後めったに見られない。少なくとも 16 g の重量を持つマウスを使用して、有害事象の可能性を削減できます。ただし、開始の重量は 18-20 g 以上、誘導肝前駆細胞の数が低くなる可能性があります。いくつか非アルコール性脂肪性肝疾患 (NAFLD) で見られるような脂肪肝、炎症、肝前駆細胞の応答、線維症、存在しなくても肝硬変の肝細胞癌の開発研究する CDE モデルを使用ことができ、B 型肝炎ウイルス感染患者21,22。比較では、慢性肝障害のチオアセトアミド (TAA) モデルより積極的な政権を表します。軽度な脂肪、炎症、肝前駆細胞とすでに 6 週時間ポイント12初期肝硬変の進行に線維化を誘導します。したがって、CDE 餌は線維症の重症度のステージは、関心のある NAFLD 関連付けられたプロセス TAA 時間コースが異なる場合有利な可能性がありますに対し研究フォーカス場合提案しました。
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Disclosures
何も作者によって開示することがありません。
Acknowledgments
この作品は、国立保健医療研究評議会 (NHMRC) のオーストラリア (APP1042370、APP1061332、APP1087125) からの助成金によって支えられました。著者は、テクニカル サポートにカーティン健康イノベーション研究所スタッフに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
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