Summary
Her beskriver vi en fælles metode for at fremkalde kronisk leverskade i mus ved fodring med en cholin-mangelfuld og ethionine-suppleret (CVU) kost. Vi demonstrere sundhedsovervågning, leveren perfusion, isolation og bevarelse. Et tidsforløb af seks uger kan informere om leverskade, pathohistology, fibrose, inflammatoriske, og leveren stamfader celle svar.
Abstract
Kroniske leversygdomme, viral hepatitis, alkoholisk leversygdom, eller ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, er karakteriseret ved stadige betændelse, fremadskridende ødelæggelse og regenerering af hepatisk parenkym, leveren stamfader celle spredning, og fibrose. Slutstadiet af hver kronisk leversygdom er skrumpelever, en stor risikofaktor for udvikling af hepatocellulært carcinom. For at studere processer regulerer sygdom indledning, etablering og progression, bruges flere dyremodeller i laboratorier. Her beskriver vi en seks-ugers tid kursus af cholin-mangelfuld og ethionine-suppleret (CVU) musemodel, som indebærer fodring seks uger gamle mandlige C57BL/6J mus med cholin-mangelfuld chow og 0,15% DL-ethionine-suppleret drikkevand. Overvågning af dyrs sundhed og en typisk organ vægt tab kurve er forklaret. Protokollen viser brutto undersøgelse af en CVU-behandlede lever og blod samling af cardiac punktering for efterfølgende serum analyser. Næste, leveren perfusion teknik og samling af forskellige hepatiske lapper for standard evalueringer er vist, herunder lever histologi vurderinger af hæmatoxylin og eosin eller Sirius rød stainings, immunfluorescent påvisning af hepatisk cellepopulationer samt transkriptom profilering af den lever mikromiljø. Denne musemodel er velegnet til at studere inflammatoriske, fibrogenic og leveren stamfader celle dynamics induceret gennem kronisk leversygdom og kan bruges til at teste potentielle terapeutiske agenter, der kan modulere disse processer.
Introduction
Leveren er den største kirtel metaboliske organ i kroppen og har mange komplekse funktioner. Centrale roller for leveren omfatter fordøjelse, stofskifte, afgiftning, opbevaring af essentielle næringsstoffer, fremstilling af blodplasma proteinkomponenter og immunitet medieret gennem bosiddende makrofager eller Kupffer celler. Leveren har en fantastisk evne til at regenerere selvom op til 70-90% af dens samlede masse er tabt. I tilfælde af akut leverskade, sådan som det ses efter en delvis hepatectomy eller acetaminophen forgiftning, formere de resterende sunde hepatocytter for at reparere skaderne i en meget koordineret proces1. Men når hepatocytter er kronisk skadet på grund af langsigtet viral infektion, alkoholisk eller ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, den inflammatoriske mikromiljø udløser aktivering af fibrose-kørsel hepatisk Stjernehus celler og den spredning af leveren stamceller (LPCs) med potentiale til at differentiere i enten cholangiocytes eller hepatocytter2,3,4,5. Den præcise oprindelse, differentiering skæbne af LPCs, deres bidrag til leveren regenerering og hepatocarcinogenesis har været emner for en intens debat og sandsynligvis afhænger kvæstelsernes og sammenhæng2. Rækkefølgen af tidlige regenerering-associerede begivenheder diskuteres også kontroversielt, med nogle efterforskere, hvorefter hepatisk Stjernehus celle aktivering og matrix remodellering er afgørende for generation af en LPC-favorisere niche6, mens andre betænkningen at LPC udvidelse og den såkaldte kanalsystem reaktion er forpligtet til at udløse fibrogenesis7. Der er adskillige dyremodeller for at undersøge specifikke aspekter af skade og regenerering, i et forsøg på at forstå alle de underliggende faktorer, der regulerer sygdomsprogression og i sidste ende udvikle nye behandling strategier for patienter8.
Cholin-mangelfuld og ethionine-suppleret (CVU) kosten modellen blev oprindeligt udviklet til brug i rotter og senere ændret til kronisk leverskade induktion i mus9,10. Kosten mangel af cholin resulterer i nedsat forsamling og sekretion af meget low-density lipoprotein. Kombineret med hepatocarcinogen DL-ethionine, dette regime fører til overdreven hepatisk fedt lastning, kontinuerlig inflammation, periportal fibrose, LPC svar og langsigtede hepatocellulært carcinom udvikling11,12 . Men vigtigere, forskellige mus stammer udviser karakteristiske mønstre af inflammatoriske, fibrogenic og LPC svar dynamics13. Denne protokol beskriver kronisk leverskade induktion i C57BL/6J mus, de mest almindeligt anvendte indavlede mus stamme.
I kronisk leversygdom forskning omfatter typiske analyser histologiske vurderinger af hæmatoxylin og eosin samt Sirius rød farvning for at visualisere kollagen depositioner, immunhistokemisk eller immunfluorescent påvisning af hepatisk cellepopulationer, transkriptom analyse af den lever mikromiljø, der orchestrates de inducerede cellulære ændringer gennem komplekse vækstfaktor og cytokin netværk14,15,16,17 , 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyre eksperimenter
alle dyreforsøg, der er beskrevet i denne undersøgelse blev godkendt af Curtin University dyr etiske komité (godkendelsesnummer: AEC_2014_28) forud for påbegyndelsen af den eksperimenter og udføres i overensstemmelse med de australske kode for pleje og brug af dyr.
- Dyr
- bruger seks uger gamle mandlige C57BL/6J mus til forsøgene.
- Eksperimentelle design
- efter ankomst til dyr facilitet, tillade mus til at akklimatisere i fire dage før påbegyndelsen af ethvert eksperimenter.
- Hus mus på wheaten bukkene sengetøj, som er blevet forarmet af synlige kerner og stilke og holde mus på 12-timers dag/nat cyklusser i individuelt ventileret bure. Ændring af sengetøj på dage, tre og syv, derefter ugentligt derefter.
- Give mus med ad libitum adgang til cholin-mangelfuld kost og drikkevand suppleret med 0,15% af DL-ethionine. Holde DL-ethionine-suppleret vand ved 4° C og erstatte drikkevand hver anden dag for at sikre friskhed og tilskynde til drikkevand. Top op cholin-mangelfuld chow hver anden dag med en fuldstændig ændring af chow en gang om ugen.
- Observere mus i hvile og under håndteringen. Skærm standard tegn på dyrs sundhed, herunder generelle udseende, positur, social interaktion, grooming, pels betingelse, og kropsvægt.
- Vejer mus dagligt i de første to uger af eksperiment at sikre ethvert dyr, der udviser mere end 20% krop vægttab er euthanized for at begrænse unødig lidelse. Dette er typisk tilfældet i mindre end 5% af dyrene. Efter to uger, hyppigheden af vejning kan reduceres til tre gange ugentlig (f.eks. mandag, onsdag, fredag).
- Lever perfusion og isolation
- bedøver mus på angivne tidspunkter (i denne undersøgelse en, to og seks uger på CVU kost) med ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) af intraperitoneal injektion. Test pedal tilbagetrækning refleks for at sikre tilstrækkelig anæstesi.
- Våd pels med 70% ethanol og gøre en lodret midterlinjen indsnit i bugvæggen op til mellemgulvet ved hjælp af Mayo saks. Brystkassen kan fjernes for lettere adgang til hjertet.
- Indsamle blod af langsom hjerte punktering ved hjælp af en 25 G x 1/2 " regelmæssig væg nål for at undgå kollaps af hjertet. Tillade blodet at størkne i et microcentrifuge rør ved stuetemperatur til at fremskaffe serumprøver efter centrifugering ved 2.000 x g i 10 min. Senere, måle serum alanin transaminase niveauer af standardprocedurer 12.
- Flytte maven og tyndtarmen til side og udsætte Vena. Skære hjertet ved hjælp af Mayo saks til tillader væske at forlade og perfuse leveren med steril fosfatbufferet saltvand (pH = 7.4) af cannulating Vena ved hjælp af en 27 G x 1/2 " regelmæssig væg nål. En jævnt blancheret leveren angiver vellykket perfusion af alle lever fliger.
- Forsigtigt løsne leveren og placere det i en petriskål ved hjælp af Mayo saks og pincet. Fjern overskydende, non-lever væv og en galdeblæren.
- Lever bevarelse
- efter den samlede leveren vægt er blevet registreret, skæres en lille lap i flere små stykker af et par kvadrat millimeter, overføre dem til sterile rør, og snap-freeze i flydende nitrogen for senere RNA og protein udvinding, som pr standardprotokoller. Snap-fryse disse væv stykker så hurtigt som muligt efter orgel samling til at undgå enhver forringelse af væv.
- Indsamle en lap i 10% neutrale bufferet formalin til senere forarbejdning og paraffin indlejring, som pr standardprotokoller.
- Sted én lap i en støbeform, fyldt med optimal opskæring temperatur cryomatrix indlejring harpiks og snap-freeze i flydende nitrogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele seks-ugers tid løbet af CVU-induceret kronisk leverskade, blev parametre vurderet på dage 7 (induktion fase), 14 og 21 (etableringsfasen) og 42 (vedligeholdelsesfasen). I forhold til kontrol mus, CVU-behandlede mus tabte op til 20% af deres oprindelige kropsvægt i en indledende tilpasning fase og har tendens til at genvinde vægt i etablering og vedligeholdelse (figur 1). Kropsvægten var omvendt korreleret med serum alanin transaminase niveauer, en indikator for hepatocellulært skade (figur 2). Fire mikrometer-tynd og formalin-fast paraffin-embedded levervæv sektioner var plettet med hæmatoxylin og eosin at vurdere den hepatiske arkitektur. Sund lever vises en normal arkitektur med ordentlig snore af hepatocytter udstråler fra det centrale vene, danner den lever parenkym. Derimod viste CVU-behandlede lever langt forstyrret lever arkitektur og parenkymalt infiltration af mange baserig celler i induktion og etablering fase og normalisering i vedligeholdelsesfasen (figur 3). For at vurdere fibrogenesis, var 4-mikrometer tynde, formalin-fast og paraffin-embedded lever sektioner plettet med poly-azo farvestoffet Sirius rød, som visualiserer hepatisk kollagen deposition. I induktionsfasen af CVU-induceret kronisk leverskade, kollagen akkumuleret i parenkym i periportal regioner. Dog niveauer normaliseret i etablering og vedligeholdelse fase (figur 4). Matrix-indlejret og snap-frosne leveren væv blev skåret i 7-mikrometer tyndslib på en kryostaten. Immunfluorescent farvning til celle markører blev derefter udført for at analysere den tidsmæssige og rumlige arrangement af specifikke hepatisk cellepopulationer under et tidsforløb. I sund lever farvet galdeveje og leveren stamfader celle markør panCK kun galdegang strukturer, mens inflammatoriske celle markør CD45 opdaget lever fastboende makrofager eller Kupffer celler. I kronisk skadet lever afspejles øget panCK farvning imidlertid galde og leveren stamfader celleproliferation, som toppede og nåede et steady state efter ca 14 dage af CVU behandling. Antallet af CD45-positive inflammatoriske celler, der repræsenterer både leveren er hjemmehørende og infiltrerer celler, også toppede i induktionsfasen af CVU-induceret skade og langsomt normaliseret til kontrolniveauer i etablering og vedligeholdelse ( Figur 5). Denne udvidelse af inflammatoriske cellepopulationer i kronisk skadet Leverne var ledsaget af hurtige ændringer i den hepatiske mikromiljø. En hurtig induktion eller betydelig stigning i transskription niveauer af cytokiner og vækstfaktorer blev observeret. Disse omfatter tumornekrosefaktor (TNF), tumor nekrose faktor-lignende svage inducer af apoptose (TWEAK), lymphotoxin-beta (LTβ), hepatocyt vækstfaktor (HGF), omdanne vækst faktor-beta (TGFβ), og interleukin-6 (IL-6), for eksempel. Deres udskrift niveauer alle toppede i induktion fase og normaliserede fasen etablering og vedligeholdelse - lignende tidligere vist sygdom parametre (figur 6).
Figur 1 . Body vægt optagelser af sunde og CVU-behandlede mus. Kronisk skadet mus mistet op til 20% af deres oprindelige kropsvægt i induktionsfasen af CVU fodring og inddrives derefter. En repræsentativ diagram er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Serum alanin transaminase niveauer i sund og CVU-behandlede mus. Serumniveauer alanin transaminase (ALT) forblev uændret i sund mus i en seks-ugers tid løbet men toppede i induktionsfasen, med normalisering i fasen etablering og vedligeholdelse i CVU-behandlede dyr. En repræsentativ diagram er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Haematoxylin og eosin stainings af leveren sektioner. Formalin-fast og paraffin-embedded levervæv sektioner, der var plettet med H & E vist velordnet ordninger af hepatocyt ledninger i kontrol mus. Derimod var lever arkitekturen langt forstyrret i CVU-behandlede mus i induktionsfasen med normalisering i slutningen af kurset seks-ugers tid. Skalalinjen repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Sirius rød farvning-faciliteret kollagen visualisering i sund og CVU-behandlede mus. I forhold til kontrol mus, der kun vises mindre perivenous kollagen depositioner, kronisk skadet dyr viste kollagen ophobning i periportal parenkym regioner i induktionsfasen med langsom normalisering mod vedligeholdelsesfasen af den CVU tidsforløb på seks uger. Skalalinjen repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Immunfluorescent påvisning af inflammatoriske og galde/leveren stamceller. I sund lever kun biliær strukturer farves med galde og leveren stamfader celle markør panCK (rød) og CD45 antistof visualiseret leveren-resident makrofager eller Kupffer celler (grønne). I induktionsfasen af CVU fodring, antallet af CD45+ celler steg drastisk som omfattede leveren-resident samt infiltrerer inflammatoriske celler. Dette inflammatorisk respons normaliseret mod slutningen af than seks-ugers tidsforløb. Galde og leveren stamfader celler at pletten med markør panCK steg i antal op til uge to og nåede et steady state derefter. DAPI blev brugt til nukleare kvantitering. Skalalinjen repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Transkriptom analyse af cytokiner og vækstfaktorer. RNA blev isoleret fra snap-frosne stykker af CVU-behandlede leveren væv til at udføre transkriptom analyser af den lever mikromiljø. Repræsentative diagrammer af tumornekrosefaktor (TNF), TNF-lignende svage inducer af apoptose (TWEAK), lymphotoxin-beta (LTβ), hepatocyt vækstfaktor (HGF), omdanne vækst faktor-beta (TGFβ), og interleukin-6 (IL-6) er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk leversygdom er ofte en tavs sygdom med de fleste patienter bliver symptomfrie og det er en af de største bidragydere til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Kronisk alkoholisme og hepatitis C virusinfektion er de førende årsager. Kronisk leverskader er karakteriseret ved nedsat inflammation, fibrose og i svære tilfælde skrumpelever, karcinom og i sidste ende leversvigt. Der er i øjeblikket ingen kur, og selv om store EU-fremskridt har gjort at forstå mekanismerne af leversygdom, nye terapeutiske muligheder er stadig et presserende behov.
CVU kost er en enkel, tid-effektive og let sig administrere model for induktion og undersøgelse af fede ændringer eller hepatisk steatose, betændelse, fibrose, LPC spredning og i langsigtet eksperimenter, udvikling af hepatocellulært carcinom6 ,11,12,13,16,17. Oprindeligt brugt i rotter19,20, blev det senere tilpasset for at lette LPC undersøgelser i vildtype og genmodificerede mus9.
I vores laboratorium, har vi fundet det kritiske bruge wheaten bukkene i stedet for andre sengetøj alternativer. Selv om det er forarmet af synlige kerner og stilke, et par ekstra næringsstoffer forbliver i wheaten bukkene sengetøj og opveje nogle af de barske konsekvenser af CVU-induceret kronisk leverskade induktion. Derudover denne sengetøj giver miljøberigelse og tilskynder normal mad søgeadfærd i mus. Langt størstedelen af utilsigtede hændelser blev observeret i den første uge af CVU behandling og sjældent set derefter. Sandsynligheden for, at utilsigtede hændelser kan reduceres ved hjælp af mus, der har en startvægt på mindst 16 g. Men hvis den startvægt er mere end 18-20 g, antallet af inducerede lever stamceller kan være lavere. CVU model kan bruges til at studere hepatisk steatose, betændelse, leveren stamfader celle svar, fibrose og hepatocellulært carcinom udvikling uden tilstedeværelse af skrumpelever, som set i nogle ikke-alkoholiske fedtlever leversygdom (NAFLD) og hepatitis B virus-inficerede patienter21,22. I sammenligning repræsenterer thioacetamide (TAA) model af kronisk leverskade en mere aggressiv regime. Det inducerer mild fede ændringer, betændelse, leveren stamceller og fibrose, der allerede udvikler sig til tidlige skrumpelever omkring 6-ugers tidspunkt12. Derfor, CVU fodring er foreslået hvis NAFLD-associerede processer er undersøgelse fokus, mens en TAA tidsforløb kan være fordelagtig, da forskellige stadier af fibrose sværhedsgraden er af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er intet at være oplyst af forfatterne.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) i Australien (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Forfatterne vil gerne takke Curtin sundhed Innovation Research Institute medarbejdere for teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
