Summary
ショウジョウバエ大人の筋肉量を決定するための間接的な手法である筋面積を定量化する手法を報告する.筋筋強直性ジストロフィー症ショウジョウバエモデルの間接飛翔を分析することによって私たちの方法論の適用を示します。
Abstract
筋肉を無駄に、筋萎縮症として知られている神経筋症ショウジョウバエモデルの共通の表現型であります。我々 は異なった遺伝の原因によってもたらされる萎縮性表現型測定対象実験として背縦走筋 (DLM) では、具体的には、ハエの間接飛翔筋 (間) を使用しています。このプロトコルで半薄い断面のフライの胸部筋肉を埋め込む方法、筋と周囲の組織との間の良好なコントラストの入手方法、定量データの半自動獲得のための光学顕微鏡画像を処理する方法を述べると解析。方法論のパイプラインの 3 つの特定のアプリケーションについて述べる。まず、筋強直性ジストロフィー飛ぶモデルで筋変性を定量化する方法を適用する方法を示す第二に、筋断面積の測定を促進または筋萎縮や筋変性を防ぐ遺伝子を識別するために助けることができます。第三に、このプロトコルを適用して、候補化合物が病気を引き起こす突然変異による与えられた萎縮性表現型を大幅に変更することができるかどうかを判断できますまたは環境トリガーによって。
Introduction
フルーツ フライの胸部には、飛翔筋は機能的、生理的、解剖学的に全く異なる 2 つの異なるクラスが含まれています。これらの筋肉: 間接飛翔筋 (IFM) 背縦 (DLM) や背腹 (DVM) の筋肉 (図 1) と同期のフライトから成る制御筋肉1,2。これらの筋肉は、一緒に飛行のために必要な昇格した機械力を生成します。サイズ、分布との間の吻尾処分横断面3 (図 2 a) の簡単なオリエンテーションを許可します。このため、ショウジョウバエ筋萎縮の研究にこれらの筋肉を選択しました。
図 1。間接飛翔筋 (間) の配置を示すショウジョウバエ胸部の図。(左) は、横方向のビューを表します、(右) は、胸部の断面を表します。(赤) で (DLM) の背の縦筋から成る、間と背腹 (DVM) 筋肉 (緑) で。
保全組織構造と組織学的セクションの背腹軸方向の制御は、筋断面積の適切な評価を確保するために重要です。筋肉の構造を維持するために我々 はトムリンソンらから変更固定混合物を使用4 。また、筋肉は内部組織であるために、混合物は、標的組織を突き通すことができない固定として、ショウジョウバエの外骨格の不浸透性は問題であるとします。この問題を回避するためには、フライの頭、脚、翼、入力する固定混合物を許可する穴を作成する腹部の最後の 2 つのセグメントを削除しました。四酸化オスミウム (OsO4)5脂肪を修正する能力のために広く使用される治療を含めました固定プロトコルの一部としてトリグリセリドを含みます。OsO4は特に細胞レベルで非常によく、ほとんどの構造体を保持、同時にイメージにコントラストを提供しています。固定後、ショウジョウバエの thoraces は、横半薄い断面 (1.5 μ m) 用樹脂に埋め込まれていた。改良されたコントラストの組織汚すことができるさらにトルイジン ブルー。完全な thoraces の画像は、10 X で撮影された、筋面積が (等しい寸法) の画像を二値化すると ImageJ ソフトウェアの総数から筋肉組織 (黒のピクセル) に対応するピクセルの割合を定量化し, 定量化しました。
このプロトコルの導入、OsO4およびグルタールアルデヒド溶液の濃度の増加として組織化・固定化混合変更は、筋肉組織の独特な保存を許可しました。これは、プロトコルも神経筋変性疾患筋強直性ジストロフィー (DM) などに関連付けられている高度萎縮性条件で試料の事後分析の信頼性を高める、組織の変形と劣化を回避するためです。一般的な形式として、DM のタイプ 1、このまれな遺伝的疾患は、筋強直性ジストロフィー蛋白質キナーゼ(DMPK) 成績証明書の展開の CUG リピートによってもたらされます。突然変異体の DMPK RNA 集計隔離 muscleblind だったような核 RNA 結合蛋白質 (MBNL1-3; フォーム ribonuclear 巣ショウジョウバエの muscleblind だった (Mbl)) の6。筋肉のミオシン重鎖プロモーター (Mhc Gal4) 250 CTG の繰り返しを表現することにより筋強直性ジストロフィーのショウジョウバエモデルを生成されます。モデル ハエのアップ開催羽' 典型的な表現型と飛べないしていた深刻な筋萎縮の間 (図 2 b)。私たちの研究室で実行前の研究では、間の筋肉領域の決定は、これらモデル ハエ7筋萎縮のさまざまな化学物質や遺伝的修飾キーの効果を定量化する信頼性の高い方法を示しています。例として 250 CTG を表現するハエの C は筋肉で繰り返される Mbl アイソ フォームの発現は、隔離で Mbl 枯渇は DM1 病態8 (図 2) でトリガーの要因として筋地域の救助を達成しました。Abp1、実績のある反 DM1 活動9 (図 2 D) ヘキサペプチドとハエの DM モデルを供給した後が筋面積も助かった。
図 2。大人の thoraces を樹脂包埋の卵割のセクションの定量化。関連遺伝子多型の指定されたショウジョウバエ(A ~ D) 間接飛翔筋。(A) 制御は飛ぶ (和田) です。(250 以外のコーディング CTG の式 B) を繰り返す筋肉で (UAS-CTG(250)x)コントロール ハエと比較して DLMs の筋面積の減少を引き起こした。(C) この筋萎縮の表現型は muscleblind だった (MblC) の過剰発現によって救出された (UA CTG (250) UAS MblC x) (D) を供給 (UA CTG (250) x Abp1) ヘキサペプチド Abp1 にモデル ハエ。すべての画像では、背側は上です。遺伝子が筋肉のミオシン重鎖プロモーター (Mhc) を使用してに追い込まれた-Gal4。(E) 定量制御ハエを基準として筋肉の割合の差が認められたことを確認しました。ヒストグラムを示しています意味 ± S.E.M. * *p< 0.01 と * p < 0.05 (Student´s t-テスト)。スケール バー: 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ここで報告する方法は、筋肉の発達、メンテナンスと高齢化、病の病理、薬物検査筋肉組織が内因性および外部要因に応答する方法についての信頼できる情報を提供に焦点を当て研究者に興味になります。
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Protocol
1. 固定と樹脂埋め込み
- 二酸化炭素 (CO2) もしくは氷ブロックを使用して低体温症ハエを麻酔します。(全体の飛行を参照する低倍率) と管の内径とはさみを使って、足、翼、頭、固定液の浸透を促進する腹部の末端部を外します。死体の処理は、胸郭の変形を避けるためにこのステップで必要な注意してください。
注意: 手順の最後で適切に処理された個人の十分な数を確保する遺伝子型あたりの少なくとも 12 のハエから始まります。 - ソリューション 1 の氷 (チューブあたり 6 人の最大を置く) 含む 200 μ L に 1.5 mL チューブに死体を転送します。
注: 死体は、20 分以上解決策 1 で残ることができません。- 解決策 1、これらのボリュームの割合でコンポーネントを混在させる: ¼ 0.2 M NaH2PO4¼ 0.2 M Na2HPO4 8% グルタルアルデヒドの ¼ ¼ 4% パラホルムアルデヒド。
- ソリューション 2 の 200 μ L を追加し、氷上で 30 分間インキュベートします。
- 解決策 2: は、解決策 1 と 1:1 (v/v) の割合で OsO4を混ぜます。
注意: OsO4は非常に有毒です。適切な安全対策と発煙のフードを操作します。
- 解決策 2: は、解決策 1 と 1:1 (v/v) の割合で OsO4を混ぜます。
- すべての液体を削除します。解決策 2 を 200 μ l 添加し、1-2 時間の氷の上を孵化させなさい。
- ソリューションを削除して、傾斜エタノール シリーズを通してサンプルを次のように脱水: 一度で 30%、50%、70%、90%、2 回で絶対エタノール;5 分ごと。サンプルをカバーするエタノール 1 mL を追加します。
注: 組織は 90% エタノールで配置されると、後続の手順は室温で実行できます。 - 各インキュベーション 2 回 10 分のプロピレンの酸化物のサンプルをインキュベートします。
注意: プロピレンの酸化物は有毒、発煙のフードで使用します。 - 1:1 (v/v) エポキシ樹脂及びプロピレンの酸化物の混合物で酸化プロピレンを交換し、一晩室温で孵化させなさい。
注意: 樹脂は、液体状態非常に有毒です。樹脂 (A、B、C、D) の 4 つのコンポーネントのセットとして提供されます。- エポキシ樹脂、追加使い捨てビーカーの樹脂 (A)、硬化剤の 44.5 g 54 g で 2.5 g 加速器の (C) と 10 g の可塑剤の (B) (D)。発煙のフードのすべての樹脂部品を組み合わせます。(6 ヶ月) のための-20 ° c または-80 ° c (数年) の因数で樹脂を格納します。
- 樹脂を破棄するには、固体樹脂は有害ではないので 24 h 70 ° C で焼きます。ソリューションは、OsO の痕跡を含めることができますので、適切な国際手続に従って重金属グループのすべての以前のソリューションを破棄4.
- 100% 樹脂で以前の混合物を交換し、4 時間サンプルをインキュベートします。
- 新しい樹脂 (金型の各ウェルで 1 つ死体) を含むプラスチック金型に死体を転送します。削った木の棒や針を使用して転送、井戸に死体を方向づけるし、一晩パスツール オーブン 70 ° C で重合する樹脂のまま
注: 臼歯トリミングとセクショニングの死体の適切な向きを確保するため、死体で横たわるべき彼らの長い側に井戸の端に近い非常に枝肉の前部で。
2. トリミングとブロックの断面
- 金型から重合樹脂ブロックを削除します。かみそりの刃を使用して、樹脂をトリムし、死体を取り巻く台形形状を形成するミクロトームで適切な方向を与えます。匹敵する結果を得るため横縫合後すべての死体をセクショニングを開始します。
注: セクションは、サンプルを正しくトリムする DLMs の前後軸に垂直でなければなりません (図 3)。
図 3.筋強直性ジストロフィーの大人 thoraces を樹脂包埋の卵割セクション モデル ハエ。(A) 試料のトリミングは画像右背側部のセクションは完全に筋肉に横なかった正しいでした。結果として、上部右側にある 3 つの筋束は左サイドのものよりも大きく見えます。この間違いは、筋面積の過大評価になります。(B) 正しくトリム樹脂ブロックの断面。スケール バー: 200 μ m。
- 1.5 μ m、ウルトラミクロトームと分厚い部分をカットし、糊のスライドにわたって水滴にセクションを転送します。
- 匹敵する結果を取得するすべてのサンプルの mesothorax セグメントからセクションを取得します。
- H2O が蒸発するまでに 70-80 ° C で加熱ブロックのセクションを含むスライドを配置します。この時点で、サンプルは、OsO4コントラスト (図 4 a) で観察できます。
3. IFM セクションを汚す
- 十分なトルイジン ブルー約 30 のセクションをカバー暖房のブロックの s。
- トルイジン ブルー ソリューション、トルイジン ブルーの 1%、H2o. のホウ砂の 1% を解散します。
- H2O で洗浄し、水を蒸発する暖かいプレートにスライドを残します。染色トルイジン ブルー コントラストをする必要がある場合を繰り返します (図 4 b) を強化します。
図 4.異なるコントラスト染色と大人の thoraces を樹脂包埋の卵割セクション。両方のパネルは、DM1 モデル ハエ Abp1図 2Dのようにうんざりの画像を表示します。(A) OsO4コントラストを持つセクションのイメージ。(B) セクションとトルイジン ブルー染色により筋の筋束のより良い視覚化できます。スケール バー: 200 μ m。
4. 取り付け IFM セクション
- H2O が蒸発するまで加熱ブロック スライドを乾燥します。
- セクションにメディアをマウントの 1 または 2 滴を入れて、上を置きます。
注意: は、メディアをマウントは有毒であるため発煙のフードでこの手順を実行します。
5. 画像と筋肉領域の定量化の取得
- DLM 筋肉のセット全体がフォーカスになるよう低倍率で画像を撮影します。我々 は通常、10 X を使用します。
- 統計分析のためフライあたり少なくとも 5 連続画像を撮影し、, 実験群あたり少なくとも 5 ハエを分析します。
- 全身の筋肉群 (図 5 a) を含むイメージを選択します。軸またはセクションの向きを確認し、結果を歪める不適切な方向にサンプルを破棄 (図 3 a を比較/ひどく区別する 3 b と配向のセクション、それぞれ)。
- DLMs (図 5 a/5B) のみを含むピクセル単位で領域を選択するのに ImageJ ソフトウェアを使用します。使用する参照領域には異なる実験群間比較のため最大筋肉とフライ常でしょう。比較する異なる遺伝子型のすべての画像では、参照領域 (図 5 b) に等しい大きさの DLMs を含む領域を選択します。
- 画像 J コマンドで画像を 2 値化する:プロセス/バイナリ/作るバイナリ分野や関心 (図 5) の筋肉に対応しないピクセルを削除します。
- Artefactual 黒い斑点が筋以外の領域に表示される場合は、描画ツールのコマンドでそれらを削除し、消しゴムのシンボルを選択します。
図 5.筋肉の領域を決定するための解析手順をイメージします。(A) 横断部筋強直性ジストロフィー 1 型モデルは、DLM を含む四角形で胸部を飛ぶ。(B) 選択したエリアだけ間接飛翔筋と腸 (*)。(C) Binarized 画像。黒の領域は、目的の筋肉に対応します。腸は、筋肉領域の正確な定量化のため消されています。スケール バー: 200 μ m。
- コマンドの総数から筋肉組織 (黒のピクセル) に対応するピクセルの割合を数値化:分析/計測・面積率オプションを選択します。この領域の割合は、それぞれのフライの DLM 筋肉量の推定です。
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Representative Results
MblC の過剰発現または Abp1 の管理は筋強直性ジストロフィーのフライ モデルの萎縮性の表現型効果をもたらしたかどうかを定量化するには、間 (図 1) の一部である Dlm に着目。我々 はミオシン重鎖プロモーター (Mhc) によって駆動される筋肉全体で 250 以外のコーディング CTG の繰り返しを表現するモデルが飛ぶことを決定-Gal4、いたハエをコントロールと比較して筋面積の 50% 削減。対照的に、同じドライバーの MblC と拡張 CTG の繰り返しの共発現が強くこのような表現型を抑制し、crossectional 筋エリア コントロール (通常の) ハエの 70% であった。栄養媒体の Abp1 ヘキサペプチドの管理は同様に萎縮性表現型と (DM1 ハエ; 典型的な 50% ではなく正常な筋肉の面積の約 60% を示した化合物を撮影していたモデル ハエを抑制図 2 e)。これらのサンプルの定量化、トルイジン ブルー コントラスト (図 4および5) を高めるために染色を使用しました。
我々 は、プロシージャの間に技術的な不具合の数が大幅最終の定量化と干渉する注意してください。共通の 1 つは、樹脂製ブロック正しく切り捨てられません、サンプルを misorient し、DLMs の斜め切断につながる場合があります。結果として、いくつかの DLM の筋肉が対側に比べて 1 つの側面に大きく見えるかもしれませんが(たとえば図 3を参照)、最終的な数量に大きな誤差を紹介します。発生するもう一つの間違いは、劣化・変形筋肉領域の正確な定量化は不可能に見える筋肉組織 (図 6) の定着剤の不十分な浸透です。
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Discussion
キイロショウジョウバエが人間の神経筋疾患7,10,11の出現によって特徴付けられる筋強直性ジストロフィーの研究に有用なモデルであることが実証されています。筋肉の萎縮。ここで提示されたプロトコルは、発症やフライのモデルの特定の病気の進行による筋変性を定量化するための便利なツールです。たとえばに従うし、さまざまな年齢層のハエでこの分析を実行することによって筋線維の変性を定量化することが可能ですも。
プロトコルの重要なステップがあります。組織の劣化を避けるために、固定する前にハエを分析するために必要な時間を最小限にする必要があります。(図 6) の筋肉の固定液の浸透、頭、翼とフライのインテリアへのソリューションのアクセスを確保するハエの足を削除することが重要です。関心の筋肉は全く見えない横断セクションを得るために不可欠です。定量化のためのサンプルの 2 値化は、選択したピクセル (黒ピクセル) が興味の組織と関心の全領域に対応するメモが選択されるので重要です。
図 6。サンプルの処理中に、組織の変形と劣化をおこす筋肉 (*) の定着剤の不十分な浸透と大人のショウジョウバエ胸部。スケール バー: 200 μ m。
このプロトコルで使用する試薬の 1 つは、OsO4、特に細胞レベルで非常によく、ほとんどの構造体を保持し、同時に提供画像5とは対照的です。ただし、メソッドの重要な欠点は、OsO4発煙のフードで常に使用する必要があります安全な取り扱いと廃棄が必要との毒性です。このプロトコルは、だけでなく筋埋め込み手順と定着のための正確な定量化を可能にする、電子顕微鏡検査 (EM) 準備など他のアプリケーションにも使用できます。しかし、免疫組織化学などの後続のアッセイの結果の組織切片を使用できないため本質的な制限を受けます。
最後に、この方法はまた遺伝的に修飾子を確実に識別できるように小さな筋肉領域の違いを検出する最適化されてまたは化学が8,9をスクリーンします。それにもかかわらず、増加筋面積、必ずしも良い筋肉の機能を意味するので断面筋決定必要があります理想的と関連付ける機能アッセイ飛行試金12など。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
著者は、このプロトコルのフィードバックと改善の並進のゲノム グループとキャスリン J ハンソンのメンバーに感謝したいと思います。このプロジェクトは研究助成金 SAF2015-64500-R、ヨーロッパ地域開発資金、Ministerio デ エコノミア y Competitividad R.A に授与を含むとを行った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
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