Применение высокоскоростных суперразрешением скорость микроскопии в прямом первичной ресничку
Summary
Недавно мы сопоставлены трехмерной (3D) пространственного расположения транспортных маршрутов для различных белков, translocating внутри первичного реснички в живых клетках. Здесь этот документ детали экспериментальной установки, процесс биологических проб и анализ данных для флуоресценции 3D супер-резолюции, недавно изображений подход применяется в живут первичной ресничек.
Abstract
Основной ресничку на основе микротрубочек выступ на поверхности многих эукариотических клеток и содержит уникальный состав белков функции критически в подвижности клеток и сигнализации. Так как реснички не способны синтезировать свои собственные белки, около 200 уникальных цилиарной белки нужно торговли между в цитозоле и первичных ресничек. Однако, это по-прежнему технический вызов карта трехмерные (3D) расположения транспортных путей для этих белков в живой первичной реснички из-за ограничений в настоящее время существующих методов. Чтобы победить вызов, недавно мы разработали и занятых высокоскоростной виртуальный 3D супер резолюции микроскопии, называют точечные края возбуждения суб дифракции (скорость) микроскопия, чтобы определить 3D пространственное расположение транспортных путей для Оба цитозольной и мембранных белков в первичной реснички живых клеток. В этой статье мы покажем подробные настройки скорости микроскопии, подготовка клеток, выражая флуоресцировани обозначенного белка цилиарной белки, слежение в реальном времени одной молекулы индивидуальных белков в живой ресничку и достижения из 3D пространственных вероятностных карт плотности транспортных маршрутов для ресничный белков.
Introduction
Так как заявил Эрнст Аббе в 1873 году, резолюции обычных световой микроскопии было считается ограничивается примерно 200 Нм вследствие дифракции света от объективного1,2. В настоящее время методы световой микроскопии суперразрешением нарушать это ограничение и разрешить захват динамических изображений с разрешением суб дифракции (< 200 Нм). Методы, как правило, делятся на две широкие категории: стимулировали выбросов истощения (интереса) микроскопии основанные подходы, которые генерируют объем освещения суб дифракции вследствие нелинейных оптических ответ флуорофоров в образцы3; и photoactivated световой микроскопии (PALM) и стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)-на основе суперразрешением методы, которые используют математические функции для локализации центроиды флуорофоров и затем восстановить эти центроиды сформировать суперразрешением изображения4,5. В настоящее время благодаря сравнительно несложной оптические установки, PALM шторм широко используются и активируя только небольшое подмножество флуорофоров в каждом фрейме долго видео биологической подготовки. Это позволяет для более точной локализации по 2D Гаусса фитинга флуоресцентные пятна, называется точка распространения функция (ФСФ), дневно меченых белков в каждом кадре видео. 2D расположение каждого дневно меченых молекул может затем накладывается на одной плоскости изображений для создания изображения суперразрешением биологической подготовки1,2. Хотя эти сингл молекула локализации, супер резолюции подходы к микроскопии конечно революцию, как было выполнено визуализации биологических образцов, есть еще проблемы, которые необходимо преодолеть. Например шторм и PALM могут достигнуть их лучших пространственного разрешения после фиксации биологических образцов и таким образом представлять статическое представление дневно меченых белков, который является аналогичные ограничения электронной микроскопии. Кроме того для достижения высокого пространственного разрешения для каждого белка-дневно обозначенных в живых клеток, образцы должны быть imaged на очень длинные частоты кадров, которые не в состоянии захватить динамики белков. Таким образом это необходимо для преодоления этих основных технических препятствий.
Чтобы получить высокое разрешение пространственно-временных, которая хорошо подходит для обнаружения быстро движущихся белков и РНК в живых клеток, мы разработали супер-резолюции скорость микроскопии в нашей лаборатории (рис. 1)6,7, 8. несколько крупных технических достижений в микроскопии скорость ранее позволили нам успешно отслеживать nucleocytoplasmic перевозок малых молекул, белки, мРНК и вирус через родной ядерной поры комплексы (НПС)6, 7 , 8. кратко, следующие особенности микроскопии скорость будет использоваться для отслеживания быстро движущихся макромолекул через суб микрометра осесимметричной структуры в живых клеток, таких как NPC и первичных реснички: (1) наклонной или вертикальная подсветка ПСФ позволяет возбуждения молекул одного внутри небольшой дифракционный предел тома в фокальной плоскости (рис. 1); (2) склонны ПСФ можно значительно избежать вне фокуса флуоресценции и таким образом улучшить соотношение сигнал шум. (3) оптическая плотность 100-500 кВт /2 см в ПСФ освещения позволяет тысячи фотоны должны быть собраны из одного флуорофоров с быстрого обнаружения скорости (> 500 Гц). (4) быстрого обнаружения скорость также значительно уменьшает сингл молекула пространственной локализации ошибки (< 10 Нм) при определении пространственных траекторий перемещения флуоресцентных молекул в живых клеток, потому что молекулярной диффузии является одним из основных факторов причиной несовершенства одной молекулы локализации для движущихся молекул. (5) налаженные 2D к 3D алгоритмы преобразования позволяют нам предоставлять 3D пространственных вероятностных карт плотности транспортных маршрутов для молекул в NPC или первичной ресничку. Примечательно, что наш процесс преобразования между декартовой и цилиндрических координации системы используется для создания 3D пространственной плотности вероятности карта, вместо того, чтобы 3D сингл молекула отслеживания (рис. 2). Ранее электронной микроскопии данные показали, что ВСНП9,10 и основной ресничку11 имеют осесимметричной структуры. В принципе случайно диффундирующих молекул, движущихся через NPC или первичной ресничку должны также иметь осесимметричной дистрибутивов. Как показано на рисунке 2, большое количество случайно диффундирующих молекул внутри цилиндра будет генерировать осесимметричной дистрибутивов на вид поперечного сечения, что в NPC, далее привело примерно единообразной пространственной распределение в рамках каждого очень маленькие субрегиона между двумя соседними кольцами (2 рисунокE). Это равномерное распределение приводит, что пространственное распределение измерении θ в цилиндрической системе является постоянным. Затем можно упростить 3D координаты (X, R, θ) быть 2D координат (R, X, константа). На самом деле наш процесс преобразования между декартовой и цилиндрических системами является от 2D (X, Y) 2D (R, X, константа). Постоянное θ, относится к пространственной плотности p в рисунке 2E, рассчитывается с помощью уравнения A
.
В конечном счете сингл молекула отслеживания имеет широкое применение в биологических исследований, таким образом, вполне естественно, что множество методов будут разрабатываться для заполнения конкретных биологических нишах12,,1314. Так обстоит дело с скорость микроскопии. Ранее при сочетании с 3D преобразования алгоритма, этот метод был разработан для устранения 3D транспортных маршрутов транзитных молекул через НПК, суб-diffraction-размера и вращательно-симметричных биологической структуры6. В этом документе первичный ресничек показано отличную модель органеллы также. Основная ресничек, цилиндрические, антенна как органеллы (~ 125 Нм радиус), которые проектируют от поверхности наиболее mammalian клетки15,16,17. Они отвечают за получение внешних сигналов и препровождающее внутриклеточные реакции, обычно связанных с ростом и метаболизм,1516. Таким образом, поток структурных белков, утилизация трансмембранные рецепторы и передаче внутриклеточных посланников жизненно важные обязанности основного ресничек. На стыке между первичной ресничек и клетки тела является критической избирательности барьер, называется переходной зоне или TZ, через который все это транспортного белка должно произойти,11,18,19 20. Подуманы, что помимо стробирования функции TZ, по крайней мере два транспортных процессов, intraflagellar транспорт и пассивной диффузии, отвечает за движение белка через этот регион16,21, 22. с точки зрения здоровья человека, потеря первичных ресничек и последующего дерегулирования течению сигнализации характерно многих раковых заболеваний. Кроме того многие генетических заболеваний, как Синдром Барде-Бидля и поликистозный болезни почек, связаны с дефектных белков транспорт23. Ограничение на размер суб дифракции и сложный процесс селективного белка транспорта через TZ сделать основной реснички главной мишенью для этой техники. В этом документе методы, мы продемонстрируем отслеживания цилиарной трансмембранным белком рецепторов соматостатина 3 (SSTR3)24, внешне помечены Alexa Fluor 647 и компонент IFT, IFT2025, помечены с молекулой плавленого GFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает применение микроскопии скорость основного ресничку, клеточных сигналов органеллы, который очень зависит от эффективного белков транспорт. СКОРОСТЬ микроскопии может обеспечить высокого разрешения (< 10 Нм) мест для дневно меченых молекул, как они проходят через…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Кристен верхей (Мичиганского университета, Анн-Арбор) и д-р Грегори Pazour (Университет штата Массачусетс Медицинская школа) за предоставление некоторые плазмиды. Проект был поддержан грантов от национальных институтов здравоохранения (низ GM097037, GM116204 и GM122552 к W.Y.).
Materials
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25×36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
Riferimenti
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -. W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell’s antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscienze. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
