الجمع بين الخلية الانقسامية المزامنة وعالية الدقة [كنفوكل] الفحص المجهري لدراسة دور البروتينات المتعددة الوظائف دورة الخلية أثناء الانقسام
Summary
نقدم بروتوكولا للتزامن thymidine مزدوجة من خلايا هيلا متبوعاً بالتحليل باستخدام دقة عالية [كنفوكل] مجهرية. هذا الأسلوب هو المفتاح للحصول على عدد كبير من الخلايا التي تشرع شكل متزامن من مرحلة ثانية للانقسام، تمكين الدراسات المتعلقة بأدوار الانقسامية من البروتينات المتعددة الوظائف التي تمتلك أيضا مهام الطور البيني.
Abstract
وتقدم الدراسة مختلف الأحداث التنظيمية لدورة الخلية بطريقة تعتمد على مرحلة فهم واضح حول نمو الخلايا وشعبة. تزامن السكان خلية في مراحل معينة من دورة الخلية قد وجد أن تكون مفيدة جداً في مثل هذه المساعي التجريبية. المزامنة للخلايا بالعلاج بالمواد الكيميائية التي نسبيا أقل سمية يمكن أن تكون مفيدة عبر استخدام العقاقير الدوائية المثبطة لدراسة دورة الخلية ما يترتب عليها من أحداث، والحصول على إثراء محددة المراحل الانقسامية المحدد. هنا، يمكننا وصف البروتوكول لمزامنة الخلايا البشرية في مراحل مختلفة من الخلية دورة، بما في ذلك على حد سواء في مرحلة ثانية وم مع كتلة thymidine مزدوجة والإصدار الداخلي لدراسة الأداء الوظيفي للبروتينات الانقسامية في محاذاة كروموسوم والعزل. هذا البروتوكول كانت مفيدة للغاية لدراسة أدوار الانقسامية من البروتينات المتعددة الوظائف التي تملك وظائف ثابتة الطور البيني. في حالتنا، الانقسامية دور Cdt1، بروتين حاسمة بالنسبة للنسخ المتماثل الترخيص الأصلية في المرحلة G1، يمكن دراسة فعالية إلا عندما يمكن أن تنضب Cdt1 G2/M-محددة. ونحن تصف البروتوكول مفصلاً لاستنفاد Cdt1 G2/M-خاصة باستخدام المزامنة thymidine مزدوجة. ونحن أيضا تفسير البروتوكول لتثبيت الخلية، ويعيش تصوير الخلية استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] عالية الدقة بعد الإفراج عن thymidine. الأسلوب أيضا مفيدة لتحليل وظيفة البروتينات الانقسامية في ظل الظروف الفسيولوجية والقلق على حد سواء كما هو الحال ل Hec1، مكون من Ndc80 المعقدة، كما أنها تمكن واحد للحصول على أحجام عينات كبيرة من الخلايا الانقسامية للخلايا الثابتة ويعيش تحليل كما نعرض هنا.
Introduction
في دورة الخلية، الخلايا الخضوع لسلسلة من الأحداث عالية التنظيم والتي تسيطر عليها وقتيا لازدواجية دقيقة للجينوم والانتشار. في الثدييات، تتألف من الطور البيني والمرحلة م دورة الخلية. في الطور البيني، الذي يتكون من ثلاث مراحل-G1, S، و G2، الخلية التكرارات الجينوم ويخضع النمو اللازمة لدورة الخلية العادية التقدم1،2. في المرحلة م، الذي يتألف من الانقسام (الطور الأول، بروميتافاسي، الطورية، طور الصعود والطور النهائي) وسيتوكينيسيس، تنتج خلية أبوية خليتين ابنه متطابقة وراثيا. في الانقسام، الأخت شقاً الصبغي للجينوم المكررة مكثف (الطور الأول)، ويتم التقاطها في كينيتوتشوريس واسطة microtubules المغزل التفتلي المجمعة (بروميتافاسي)، أن يدفع اتساقها في لوحة الطورية (الطورية) تليها بهم يساوي التفرقة عند الأخت انقسام تجاه شقاً الصبغي ونقلها إلى محور الدوران المعاكس أعمدة (طور الصعود). يتم فصل الخليتين ابنه جسديا بنشاط على أساس أكتين الهوس عصابة (الطور النهائي و cytokinesis). Kinetochore البنية البروتينية متخصصة التي تجمع في منطقة سينتروميريك من شقاً الصبغي وتكون بمثابة مواقع الحجز المغزل microtubules. وظيفتها الرئيسية هي محرك التقاط كروموسوم، والمحاذاة، والمساعدة في تصحيح مرفق microtubule شوكي غير لائق، بينما الوساطة الحاجز الجمعية المغزل للحفاظ على الإخلاص كروموسوم الفصل3،4.
تقنية التزامن الخلية بمثابة أداة مثالية لفهم الأحداث الجزيئية والهيكلية تشارك في تقدم دورة الخلية. وقد استخدمت هذا النهج إثراء سكان الخلية في مراحل محددة لأنواع مختلفة من التحليلات، بما في ذلك إنشاء تشكيل جانبي للتعبير الجيني، تحليلات للعمليات الكيميائية الحيوية الخلوية، والكشف عن التعريب سوبسيلولار من البروتينات. يمكن استخدام خلايا الثدييات متزامنة لدراسة المنتجات الجينات الفردية، بل أيضا للنهج التي تنطوي على تحليل الجينوم كله بما في ذلك تحليل الجينات التعبير5، ميرنا أنماط التعبير6، ميكرواري تنظيم متعدية الجنسيات7، وتحليل البروتين البروتين التعديلات8. يمكن أيضا استخدام المزامنة دراسة آثار التعبير الجيني أو البروتين تدق لأسفل أو المغلوب، أو المواد الكيميائية على تقدم دورة الخلية.
يمكن مزامنة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. الوسائل المادية والكيميائية تستخدم على نطاق واسع لتزامن الخلية. أهم المعايير لتزامن الخلية أن التزامن نونسيتوتوكسيك وعكسها. بسبب العواقب الخلوية الضارة المحتملة لمزامنة الخلايا وكلاء الدوائية، أساليب تعتمد على المواد الكيميائية يمكن أن تكون مفيدة لدراسة الأحداث الرئيسية الخلية دورة. على سبيل المثال، هيدروكسيوريا، أمفيديكولين، ميموسيني، ولوفاستاتين، يمكن استخدامها لمزامنة الخلية في المرحلة G1/S ولكن بسبب أثرها على المسارات البيوكيميائية التي تمنع، تفعيل آليات تفتيش دورة الخلية وتقتل هام جزء من ال9،الخلايا10. من ناحية أخرى، يمكن القبض على تثبيط التغذية المرتدة من تكرار الحمض النووي عن طريق إضافة thymidine إلى وسائط النمو، المعروفة باسم “كتلة thymidine”، دورة الخلية في بعض النقاط11،،من1213. يمكن أيضا مزامنة الخلايا في المرحلة G2/M بالتعامل مع نوكودازولي و9،رو-330614. وقد نوكودازولي، مما يمنع الجمعية ميكروتوبولي، سيتوتوكسيسيتي عالية نسبيا. وعلاوة على ذلك، يمكن إرجاع القبض على نوكودازولي الخلايا الطور البيني بريكوسيوسلي بانزلاق الانقسامية. ضعف thymidine كتلة القبض على الخلايا في المرحلة G1/S وبعد الإفراج عنهم من الكتلة، تم العثور على خلايا المضي في شكل متزامن عن طريق G2 وإلى الانقسام. ويمكن ملاحظة التقدم العادي لدورة الخلية للخلايا من كتلة thymidine تحت المجهر [كنفوكل] عالية الدقة قبل تثبيت الخلية أو تصوير حية. يمكن دراسة أثر اضطراب البروتينات الانقسامية على وجه التحديد عند إدخال الخلايا والمضي قدما من خلال الانقسام بعد الإفراج عنهم من كتلة thymidine مزدوجة. تشارك في النسخ المتماثل الترخيص المنشأ في المرحلة G1 الحمض النووي Cdt1، بروتين متعددة الوظائف، وهي أيضا مطلوبة من أجل المرفقات ميكروتوبولي kinetochore أثناء الانقسام15. دراسة وظيفة Cdt1 أثناء الانقسام، يحتاج المرء اعتماد أسلوب أن يتجنب تأثير استنفادها في النسخ المتماثل الترخيص خلال المرحلة G1، بينما في الوقت نفسه أحداث استنفادها على وجه التحديد خلال مرحلة G2/M فقط. نقدم هنا، بروتوكولات مفصلة تستند إلى كتلة thymidine مزدوجة لدراسة دور البروتينات مهام متعددة أثناء المراحل المختلفة لدورة الخلية الانقسامية بالتصوير الثابت وخلية يعيش.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأكثر أهمية وميزة التزامن thymidine مزدوج أنه يوفر عينة زيادة حجم الخلايا الانقسامية في إطار زمني قصير مع العديد من هذه الخلايا تدخل الانقسام في انسجام، مما يمكن أيضا تحليلات لمحاذاة كروموسوم، ثنائي القطب مغزل تشكيل، والعزل الصبغي بكفاءة أعلى كثيرا.
العديد من مجمعات البروتين…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للدكتور كوزو تاناكا من جامعة توهوكو باليابان لتقاسم خلايا هيلا ستابلي الإعراب عن H2B مشري–هيستون وبروتينات فلورية خضراء-α-توبولين. وأيد هذا العمل بمنحه لجنة التحقيق الوطنية إلى العنف المنزلي (R00CA178188) ومن أموال بدء التشغيل من جامعة نورث وسترن.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
Riferimenti
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
