有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた
Summary
高分解能共焦点顕微鏡を用いた解析に続いて HeLa 細胞の二重チミジン同期するためのプロトコルを提案します。このメソッドは、多数の有糸分裂、また界面機能を有する多機能性蛋白質の細胞分裂の役割の解明を可能にする S 期から同期的に進めるセルを取得するキーです。
Abstract
位相依存的に細胞周期の様々 な規制のイベントの研究は、細胞増殖と分裂についての明確な理解を提供します。細胞周期の特定の段階のセル人口の同期は、このような実験的努力で非常に役に立つ発見されています。比較的より少なく有毒な化学薬品処理による細胞の同期は、結果として細胞周期イベントの選択した分裂段階の特定の濃縮を得ようと研究の薬理学的阻害薬の使用上有利なすることができます。ここで、セルのさまざまな段階で同期のひと細胞周期 S 期と M 段階二重チミジン ブロックの両方を含むと染色体の整列の有糸分裂蛋白質の機能を研究するための手順をリリース プロトコルを説明します。分離。このプロトコルは、確立された界面の機能を持つ多機能タンパク質の細胞分裂の役割を研究するため非常に便利になっています。私たちのケースでは Cdt1、レプリケーション元ライセンス G1 期での重要な蛋白質の細胞分裂の役割を効果的に学ぶことができます G2/M 固有 Cdt1 が枯渇することができる場合にのみ。二重チミジンの同期を使用して特定の G2/M Cdt1 の枯渇のための詳しいプロトコルについて述べる。また、セル固定のプロトコルを説明し、チミジン リリース後高分解能共焦点顕微鏡を用いた細胞イメージングを住んでいます。メソッドは Hec1、複雑な Ndc80 のコンポーネントのように生理と摂動条件下で細胞分裂蛋白質の機能を分析し固定と生きている細胞の分裂期の細胞の大規模なサンプル サイズを取得することができるため便利分析も紹介します。
Introduction
細胞周期細胞は彼らのゲノムと増殖の正確な重複規制の厳しいと一時的制御イベントのシリーズを受けます。哺乳類細胞周期の間期と M 期ので構成されます。中間期の 3 つの段階 – G1、S から成っている、セル G2 のゲノムを複製し、正常な細胞周期進行1,2のために必要な成長を経る。(前期 prometaphase、中期、後期、終期) 有糸分裂と細胞質分裂から成る M 相親細胞は遺伝的に同一の 2 つの娘細胞を生成します。続いて中期プレート (中期) の整列の有糸分裂、姉妹染色分け体重複ゲノムの凝縮 (前期)、組み立て有糸分裂紡錘体 (prometaphase) の微小管による自分の体に取得されたドライブの姉妹染色分け体のに向かって分割し、反対側のスピンドルに運ばれる極 (後期) とき偏析と等しい。2 つの娘細胞は、アクチンに基づく収縮環 (終期と細胞質分裂) の活動によって物理的に分かれています。動原体染色分け体のセントロメア領域で組み立てて特殊なタンパク質の構造は、紡錘体微小管の添付ファイルをサイトとして.その主な機能は、染色体キャプチャ、配置を駆動し、染色体分離3,4の忠実性を維持するために紡錘アセンブリ チェックポイントを仲介しながら、不適切なスピンドル微小管の添付ファイルを修正することを支援することです。
セル同期の手法は、細胞周期の進行に関与する分子と構造のイベントを理解するための理想的なツールとして機能します。このアプローチは、さまざまな種類の解析、遺伝子発現のプロファイリングを含む細胞の生化学的なプロセスの解析とタンパク質の細胞内局在性の検出の特定のフェーズでセル人口を豊かに使用されています。個々 の遺伝子産物の研究のみならず遺伝子式5、miRNA 発現パターン6のマイクロ アレイ解析を含む全体のゲノムの解析を伴うアプローチ同期の哺乳類細胞を使用できます。翻訳制御7、および蛋白質の変更8のプロテオーム解析。同期は、細胞周期の進行に及ぼす影響の遺伝子発現やタンパク質ノックダウンまたはノックアウト、または化学物質の研究にも使用できます。
細胞は、細胞周期の異なった段階で同期できます。物理的、化学的、広くセル同期に使用されます。セル同期の最も重要な基準は、同期する必要があります noncytotoxic と可逆であること。潜在的な不利な細胞結果の薬理学的エージェントによってセルを同期する、ため化学依存メソッドはキー細胞周期イベントの勉強のために有利にできます。たとえば、ヒドロキシウレア、amphidicolin、ミモシン、ロバスタチン、G1/S 期の細胞の同期に使用できるが、彼らを阻害する生化学的経路の効果のために彼らは細胞周期チェックポイント機構をアクティブにし、重要なを殺すセル9,10の割合です。その一方で、「チミジン ブロック」として知られている成長媒体にチミジンを追加して DNA 複製のフィードバック阻害は特定ポイント11,12,13で細胞周期を挙げることが出来る。セルは、ノコダゾールと RO 33069,14と扱うことによって G2/m 期で同期できます。微小管重合を防ぐノコダゾールが比較的高い細胞毒性です。また、ノコダゾール逮捕細胞分裂すべりによって中間期の早期に返すことができます。二重チミジン ブロック逮捕セル G1/S 段階およびブロックからの解放後、細胞はある G2 から、有糸分裂に同期的に続行します。細胞周期細胞チミジン ブロックから解放のための通常の進行は、セル固定またはライブ イメージングによる高分解能共焦点顕微鏡の下で観察できます。セルを入力し、二重チミジン ブロックからリリース後有糸分裂に進むときに具体的に、有糸分裂蛋白質の摂動の効果を学ぶことができます。Cdt1、多機能性蛋白質、DNA 複製が G1 期でライセンスを起源に関与する有糸分裂15の中にも動原体微小管の添付ファイル必要です。有糸分裂 Cdt1 の機能を研究、レプリケーション ライセンス G1 フェーズ G2/M フェーズのみで具体的にその枯渇に影響を与えて同時に一方で、枯渇の影響を回避する手法を採用する必要があります。ここでは、固定と生細胞イメージングによる蛋白質の細胞周期の異なった段階の間に複数の機能を実行するの分裂の役割を研究する二重チミジン ブロックに基づく詳細なプロトコルを提案する.
Protocol
Representative Results
Discussion
二重チミジン同期の最も重要な利点は、染色体の整列、バイポーラの解析もでき、一斉に有糸分裂を入力これらの細胞の多くは短時間の窓の分裂期細胞の増加し、サンプル サイズを提供すること主軸形成と染色体分配のエネルギー効率の向上。
多くの規定する蛋白質複合体とシグナル伝達経路有糸分裂を通して通常進行を確保するために専念しているし、このプロセス?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCherry ヒストン H2B と GFP-α-チューブリンを安定発現 HeLa 細胞を共有するため東北大学の田中幸三に感謝しております。この作品は、DV (R00CA178188) に NCI の助成金、ノースウェスタン大学からスタートアップ資金にサポートされていました。
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
Riferimenti
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