Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.
Studie der verschiedenen Ereignisse, Regulierung des Zellzyklus in einer Phase-abhängigen Weise liefert ein klares Verständnis über Zelle Wachstum und Teilung. Die Synchronisation von Zell-Populationen in bestimmten Phasen des Zellzyklus wurde festgestellt, als sehr nützlich in diesem experimentellen bemühen. Synchronisation von Zellen durch Behandlung mit Chemikalien, die relativ weniger toxisch sind kann vorteilhaft sein, über die Verwendung von pharmakologischen hemmenden Medikamenten für die Studie der konsequente Zellzyklus Ereignisse und spezifische Anreicherung von ausgewählten mitotischen Phasen zu erhalten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Synchronisierung menschliche Zellen in den verschiedenen Phasen der Zelle Zyklus, einschließlich der beiden in S und M-Phase mit einem doppelten Thymidin-Block und Verfahren zur Untersuchung der Funktionalität der mitotischen Proteine im Chromosom Ausrichtung lassen und Segregation. Dieses Protokoll wurde äußerst nützlich für das Studium der mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die etablierten Interphase Funktionen besitzen. In unserem Fall kann die mitotische Rolle der Cdt1, entscheidend für die Replikation Herkunft Lizenzierung in G1-Phase, ein Protein effektiv studiert werden, nur wenn G2/M-spezifischen Cdt1 aufgebraucht werden können. Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Abbau der G2/M-spezifischen Cdt1 mit doppelten Thymidin-Synchronisation. Wir erklären das Protokoll der Zelle Fixierung auch live Cell Imaging mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie nach Thymidin-Release. Die Methode ist auch nützlich für die Analyse der Funktion der mitotischen Proteine unter physiologischen und gestörten Bedingungen wie z. B. für Hec1, ein Bestandteil der Ndc80 Komplex, da es eine zu große Stichproben der mitotischen Zellen für feste und live Zelle ermöglicht Analyse wie wir hier zeigen.
In den Zellzyklus durchlaufen Zellen eine Reihe von stark regulierten und zeitlich gesteuerte Events für die genaue Vervielfältigung ihrer Genom und Verbreitung. Bei Säugetieren bestehend aus den Zellzyklus Interphase und M-Phase. In Interphase, bestehend aus drei Stufen – G1, S und G2, die Zelle seines Genoms dupliziert und Wachstum, die notwendig ist für normale Zellzyklus Progression1,2erfährt. In der M-Phase, bestehend aus Mitose (Prophase, prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase) und Cytokinese, produziert eine elterliche Zelle zwei genetisch identische Tochterzellen. In Mitose, Schwester Chromatiden des doppelten Genoms sind verdichtete (Prophase) und sind an ihren Kinetochore von Mikrotubuli der montierten mitotischen Spindel (prometaphase) erfasst, das treibt ihre Ausrichtung an der Metaphase-Platte (Metaphase) gefolgt von ihrer gleich Trennung, wenn Schwester Chromatiden sind aufgeteilt in Richtung und transportiert zum gegenüberliegenden Spindel (Anaphase) Polen. Die zwei Tochterzellen sind räumlich getrennt von der Aktivität eines Actin-basierte kontraktilen Rings (Telophase und Cytokinese). Das Kinetochor ist eine spezialisierte proteinhaltige Struktur, die in der Zentromer-Region der Schwesterchromatiden montiert und dienen als Befestigung Standorte für Spindel Mikrotubuli. Seine Hauptfunktion ist zu fahren Chromosom erfassen, Ausrichtung, und Hilfe bei der Korrektur unsachgemäße Spindel Mikrotubuli Anlage, bei der Vermittlung des Spindel Baugruppe Prüfpunkt um die Treue des Chromosom Abtrennung3,4zu erhalten.
Die Technik der Zelle Synchronisation dient als ideales Werkzeug für die molekulare und strukturelle Ereignisse im Zellzyklus Fortschreiten zu verstehen. Dieser Ansatz wurde zur Zell-Populationen in bestimmten Phasen für verschiedene Arten von Analysen, einschließlich der gen-Expression profiling Analysen der zelluläre biochemische Prozesse und Erkennung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen zu bereichern. Synchronisierte Säugerzellen können nicht nur für das Studium der einzelnen Gen-Produkte, sondern auch für Ansätze mit Analyse der ganzer Genome Microarray Analyse des Gens Ausdruck5, MiRNA Ausdruck Muster6einschließlich verwendet werden, Translational Regelung7und Proteomic Analyse von Protein-Modifikationen-8. Synchronisation kann auch verwendet werden, Studie zu den Auswirkungen der gen-Expression oder Protein Knock-down oder Knock-out- oder Chemikalien auf Zellzyklus Fortschreiten.
Zellen können in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus synchronisiert werden. Physikalische und chemische Methoden sind für die Zelle Synchronisation verbreitet. Die wichtigsten Kriterien für die Synchronisierung der Zelle sind, dass Synchronisation noncytotoxic und reversibel sein sollte. Wegen der potenziellen nachteiligen zellulären folgen Zellen durch pharmakologische Wirkstoffe zu synchronisieren können chemisch-abhängige Methoden für die Untersuchung wichtigen Zellzyklus Veranstaltungen vorteilhaft sein. Z. B. Hydroxyurea, Amphidicolin, Mimosine und Lovastatin, einsetzbar für Zelle Synchronisation am G1/S-Phase aber, wegen ihrer Wirkung auf die biochemischen Bahnen, die sie hemmen sie Zellzyklus Checkpoint Mechanismen zu aktivieren und töten einen wichtigen Bruchteil der Zellen9,10. Auf der anderen Seite kann Feedback-Hemmung der DNA-Replikation durch Zugabe von Thymidin, Wachstumsmedien, bekannt als “Thymidin-Block” Zellzyklus bei bestimmten Punkten11,12,13verhaften. Zellen können auch durch die Behandlung mit Nocodazole und RO-33069,14in G2/M-Phase synchronisiert werden. Nocodazole, die Montage von Mikrotubuli verhindert, hat eine relativ hohe Zytotoxizität. Darüber hinaus können Nocodazole verhaftet Zellen zurück altklug durch mitotische Schlupf interphase. Doppelte Thymidin Block Verhaftung-Zellen am G1/S-Phase und nach der Entlassung aus dem Block, sind Zellen gefunden, synchron durch G2 und in Mitose vorzugehen. Die normale Progression des Zellzyklus für Zellen befreit Thymidin-Block kann unter hochauflösenden konfokalen Mikroskopie durch Zelle Fixierung oder live Imaging beobachtet werden. Die Auswirkungen der Störung der mitotischen Proteine kann studiert werden, besonders dann, wenn Zellen eingeben und fahren Sie durch Mitose nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block. Cdt1, ein multifunktionales Protein ist beteiligt an der DNA-Replikation Herkunft Lizenzierung in der G1-Phase und ist auch während der Mitose15für Kinetochor-Mikrotubuli-Anlagen erforderlich. Um die Funktion des Cdt1 während der Mitose zu studieren, braucht man eine Methode zu verabschieden, die die Wirkung von seiner Erschöpfung zur Replikation Lizenzierung während der G1-Phase, während gleichzeitig bewirken seine Erschöpfung speziell in der G2/M-Phase nur vermeidet. Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle basierend auf der doppelten Thymidin-Block zur Untersuchung der mitotischen Rolle von Proteinen, die mehrere Funktionen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus von festen und live-Cell Imaging.
Der wichtigsten Vorteil der doppelten Thymidin-Synchronisation ist, dass es eine höhere Stichprobengröße der mitotischen Zellen in einem kurzen Zeitfenster viele dieser Zellen in Mitose unisono bietet, wodurch auch Analysen von Chromosom Ausrichtung, bipolar Spindel-Bildung und Chromosom Segregation mit wesentlich höheren Wirkungsgrad.
Viele regulatorische Proteinkomplexe und Signalwege sind dafür normale Progression durch Mitose gewidmet und Deregulierung dieses Prozesses kann führte zu…
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar, dass Dr. Kozo Tanaka der Tohoku University, Japan für den Austausch von HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-Histon H2B und GFP-α-Tubulin. Diese Arbeit wurde durch ein NCI Zuschuss an DV (R00CA178188) und Starthilfe von der Northwestern University unterstützt.
DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
NIS-elements software | Nikon Instruments |