Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme
Summary
Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.
Abstract
Çalışma bir aşama bağlı şekilde hücre döngüsünün çeşitli düzenleyici olayların hücre büyümesi ve bölünme hakkında net bir anlayış sağlar. Hücre popülasyonlarının eşitleme hücre döngüsünün belirli aşamalarında bu tür deneysel gayretlerinde çok yararlı olduğu tespit edilmiştir. Hücreleri tarafından nispeten daha az toksik kimyasallar ile tedavi eşitlenmesi farmakolojik inhibitör uyuşturucu kullanımı sonucu hücre döngüsü olaylar ve seçili Mitotik aşamaları belirli zenginlik elde etmek için çalışma için yararlı olabilir. Burada, eşitleme insan hücreleri hücrenin farklı aşamalarında döngüsü, ikimiz de dahil olmak üzere S faz ve bir çift timidin blok-M faz ve yordam kromozom uyum içinde Mitotik proteinler işlevselliğini çalışmak için serbest bırakmak için protokol tarif ve segregasyon. Bu iletişim kuralı kurulan Interphase işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri çalışmak için son derece yararlı olmuştur. Sadece G2/M özel Cdt1 boşaldığında bizim durumumuzda, Cdt1, bir protein için lisans çoğaltma kaynağı G1 evresinde, kritik Mitotik rolü etkin bir şekilde ele. Biz Çift Kişilik timidin eşitlemeyi kullanarak tükenmesi G2/M özel Cdt1 için detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Biz de hücre fiksasyon Protokolü açıklamak ve yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu timidin yayımlanmasından sonra kullanarak hücre görüntüleme yaşamak. Yöntem de bir büyük örneklerin boyutu sabit ve canlı hücre için Mitotik hücre elde etmek kullanmasına olanak tanır Hec1, karmaşık, Ndc80 bir bileşeni için gibi fizyolojik ve perişan koşullarda Mitotik proteinlerin işlevi çözümlemek için yararlıdır analiz biz burada gösterdiği gibi.
Introduction
Hücre döngüsünde hücreleri son derece düzenli ve geçici kontrollü olayları kendi genom ve nükleer silahların yayılmasına karşı doğru çoğaltılması için bir dizi tabi. Memelilerde, hücre döngüsü interfaz ve M-faz oluşur. Interphase içinde ki üç aşamaları – G1, S, oluşur ve G2, hücre genomunu çoğaltır ve normal hücre döngüsü ilerleme1,2için gerekli olan büyüme uğrar. M-mitoz (profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz) ve sitokinez oluşan aşamasında, bir ebeveyn hücre iki genetik olarak aynı kızı hücreleri üretir. Mitoz, chromatids yinelenen genom kopyası sıkıştırılmış (profaz) vardır ve onların kinetochores monte Mitotik spindle (prometafaz), mikrotübüller tarafından yakalanır kız kardeşi bu sürücüler onların hizalama metafaz ardından plaka (metafaz) onların Ne zaman chromatids doğru bölmek ve ters dönüş için yer değiştiren kız kardeşi (anafaz) Polonyalılar segregasyon eşit. İki kızı hücreleri fiziksel olarak bir aktin esaslı contractile yüzüğü (telofaz ve sitokinez) faaliyet tarafından ayrılır. Kinetochore ve chromatids centromeric bölge çeviren özel bir proteinaceous yapı iğ mikrotübüller için ek siteler olarak hizmet. Temel işlevi kromozom yakalama, hizalama, sürücü ve uygunsuz iğ Mikrotubul eki, Milli Meclis denetim noktası kromozom segregasyon3,4kalitesini korumak için arabuluculuk yaparken düzeltme yardım etmektir.
Hücre eşitleme tekniği moleküler ve yapısal olaylar hücre döngüsü ilerlemesinde dahil anlamak için ideal bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yaklaşım belirli aşamaları için çeşitli analizler, gen ifadesi, profil oluşturma dahil olmak üzere hücresel biyokimyasal süreçlerin analizleri ve proteinlerin hücre altı yerelleştirme tespiti, hücre popülasyonlarının zenginleştirmek için kullanılmıştır. Eşitlenmiş memeli hücreleri-ebilmek var olmak kullanılmış sadece bireysel gen ürünlerinin incelenmesi için aynı zamanda Analizi Mikroarray analiz gen ifade5, miRNA ifade desenleri6dahil olmak üzere bütün genleri içeren yaklaşımlar için translasyonel yönetmelik7ve protein değişiklikler8proteomik analizi. Eşitleme gen ekspresyonu veya protein knock-down veya knock-out veya kimyasal maddelerin etkileri, hücre döngüsü gelişimi çalışma için kullanılabilir.
Hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında eşitlenebilir. Hem fiziksel hem de kimyasal yöntemler hücre senkronizasyonu için yaygın olarak kullanılır. Hücre eşitlemesi için en önemli kriterleri eşitleme noncytotoxic ve geri dönüşümlü olması gerekir vardır. Hücreleri farmakolojik ajanlar tarafından eşitleme potansiyel olumsuz hücresel sonuçları nedeniyle, kimyasal bağımlı yöntemleri anahtar hücre döngüsü olaylar eğitim için avantajlı olabilir. Örneğin, hidroksiüreye, amphidicolin, mimosine ve lovastatin, G1/S faz hücre eşitleme için kullanılabilir ancak, onlar inhibe biyokimyasal yolları üzerindeki etkileri nedeniyle onlar hücre döngüsü kontrol noktası mekanizmaları etkinleştirmek ve önemli bir öldürmek kesir hücreleri9,10. Öte yandan, DNA ikileşmesi “timidin taşı” olarak bilinen büyüme basına timidin ekleyerek geribildirim inhibisyonu hücre döngüsünün belirli Puan11,12,13tutuklayabilirsin. Hücreleri de G2/M aşamasında nocodazole ve RO-33069,14ile tedavisi ile senkronize edilebilir. Nocodazole Mikrotubul derleme önleyen bir nispeten yüksek sitotoksisite vardır. Ayrıca, hücreleri nocodazole tutuklandı tanımışlar tarafından Mitotik kayma Interphase geri dönebilirim. Çift timidin blok tutuklama hücreleri G1/S faz ve blok sürümden sonra zaman uyumlu olarak G2 ve mitoz içine devam etmek için hücreleri bulunur. Timidin bloğundan çıkış hücrelerin hücre döngüsünün normal ilerleme yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu altında hücre fiksasyon veya canlı görüntüleme tarafından görülebilir. Özellikle hücre girin ve mitoz Kişilik timidin blok sürümden sonra devam pertürbasyon Mitotik proteinlerin etkisi okudu. Cdt1, çok fonksiyonlu bir protein DNA çoğaltma kaynağı G1 aşamasında lisansı içinde yer alan ve aynı zamanda mitoz15sırasında kinetochore Mikrotubul ekleri için gereklidir. Cdt1 fonksiyonu mitoz sırasında çalışmaya bir lisans çoğaltmayı G1 aşamasında, aynı zamanda onun tükenmesi özellikle aşamasında G2/M sadece etkileyen üzerinde onun tükenmesi etkisini önler bir yöntem evlat edinmek gerekiyor. Burada, sabit ve canlı hücre görüntüleme tarafından birden fazla işlevi hücre döngüsünün farklı aşamalarında gerçekleştirme proteinlerin Mitotik rol çalışmaya Çift Kişilik timidin blok dayalı ayrıntılı iletişim kuralları mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu hücreler mitoz böylece aynı zamanda kromozom hizalama, bipolar analizlerini etkinleştirme uyum içinde girerek birçoğunu içeren bir kısa sürede pencerede Mitotik hücre bir artan örnek boyutu sağlar Çift Kişilik timidin eşitleme en önemli avantajı olduğunu oluşumu ve kromozom ayrımı çok daha yüksek verimlilik ile iğ.
Birçok düzenleyici protein kompleksleri ve sinyal yollar mitoz yoluyla normal ilerleme sağlamaya adadık ve deregülasyon bu sürecin tumorigenesis i?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stabil mCherry-Histon H2B ve GFP-α-tübülin ifade HeLa hücreleri paylaşımı için Tohoku Üniversitesi, Japonya’nın Dr Kozo Tanaka için minnettarız. Bu eser DV (R00CA178188) için bir ncı hibe ve Northwestern Üniversitesi’nden başlamak-yukarıya fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
Riferimenti
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
