Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Overvåke effekten av osmotisk Stress på sekretoriske blemmer og Exocytosis

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56537
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Summary

Osmotisk stress påvirker exocytosis og mengden av nevrotransmitter utgitt under denne prosessen. Vi viser hvordan kombinere elektrokjemiske metoder med overføring elektronmikroskop kan brukes å studere effekten av ekstracellulære osmotisk Trykk på exocytosis aktivitet, vesicle quantal størrelse og mengden av nevrotransmitter utgitt i løpet av exocytosis.

Abstract

Amperometry opptak av celler underlegges osmotisk sjokk viser at sekretoriske cellene reagerer denne fysisk stress ved å redusere exocytosis aktiviteten og mengden av nevrotransmitter løslatt fra blemmer i enkelt exocytosis hendelser. Det har blitt foreslått at reduksjonen i nevrotransmittere utvist skyldes endringer i membranen Biofysiske egenskaper når celler krympe svar osmotisk stress og med forutsetningene som påvirkes ikke sekretoriske blemmer i cellen cytoplasma av ekstracellulære osmotisk stress. Amperometry opptak av exocytosis overvåker hva slippes fra celler øyeblikket en vesicle sikringer med plasma membranen, men ikke gir informasjon på vesicle innholdet før vesicle fusion utløses. Derfor ved å kombinere amperometry opptak med andre komplementære analytiske metoder som kan karakteriserer sekretoriske blemmer før exocytosis på celler utløses gir en bredere oversikt for å undersøke hvordan sekretoriske blemmer og exocytosis prosessen påvirkes av osmotisk sjokk. Her beskriver vi hvordan utfyller amperometry med intracellulære elektrokjemisk cytometri og overføring elektronmikroskop (TEM) bildebehandling kan brukes til å simulere endringer i sekretoriske blemmer størrelse og nevrotransmitter innhold på chromaffin celler i forhold til exocytosis aktivitet før og etter eksponering for osmotisk stress. Ved å koble kvantitativ informasjon fra eksperimenter ved hjelp av alle tre analytiske metoder, var konklusjoner tidligere gjort at sekretoriske blemmer svare på ekstracellulære osmotisk stress av krymper i størrelse og redusere vesicle quantal størrelsen til opprettholde en konstant vesicle nevrotransmitter konsentrasjon. Derfor gir noen avklaring vedrørende hvorfor blemmer, svar på osmotisk stress, redusere mengden nevrotransmittere utgitt under exocytosis utgivelsen. Amperometric opptak her angi er en reversibel prosess og at vesicle etter osmotisk sjokk er fylles opp med nevrotransmittere når plassert celler er tilbakestilt i et isotonisk miljø.

Introduction

Chromaffin celler i binyrene er neuroendocrine celler som slipper nevrotransmitter molekyler i blodet. Dette skjer gjennom en mobilnettet prosess som involverer dokkingstasjon og blanding av nevrotransmitter-fylte blemmer, noe som resulterer i innhold release fra blemmer til den ekstracellulære plassen i en prosess som kalles exocytosis. Nevrotransmittere (adrenalin og noradrenalin) i chromaffin celler er aktivt fraktet med membran proteiner i store tett kjernen blemmer (LDCVs) og lagret på høye konsentrasjoner (~0.5-1 M)1,2. Akkumulering av nevrotransmittere inne LDCVs oppnås ved affinitet katekolaminer molekyler til intravesicular tett kjernen protein matrix består av chromogranin proteiner (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, og en intravesicular cocktail løsning som inneholder viktige komponenter for katekolaminer lasting og lagring i vesicle som ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM i løsningen og ~ 40 mM bundet til den protein matrix)8Mg2 + (5 mM)9, ascorbate (10-30 mM)10og en pH på ~5.511,12. LDCVs opprettholde en iso-osmotisk tilstand med cellen cytoplasma (310 mOsm/kg)13, selv om den teoretiske stoff konsentrasjonen i blemmer summere opp mer enn 750 mM. Sammensetningen av intravesicular komponentene er ikke bare viktig for lasting og lagring av katekolaminer, men også for samling av solutes til tett kjernen protein matrix. Dette reduserer osmolaritet av blemmer reduseres betydelig og kan påvirke mengden katekolaminer som slippes i løpet av exocytosis5,6.

Studier av effekten av ekstracellulære osmotisk Trykk på exocytosis prosessen av amperometric innspillingen har rapportert at høy ekstracellulære osmotisk trykk hemmer exocytosis aktivitet og reduserer antall nevrotransmittere skilles ut fra én vesicle rom4,14,15,16,17,18,19. Forklaringene av disse observasjonene har spekulert på mulig styrking av macromolecular trengsel i cellen cytoplasma hemme vesicle fusion hendelsene, og en endring i membranen Biofysiske egenskaper påvirker antall nevrotransmittere utgitt under exocytosis. Disse tankene antatt at høy ekstracellulære osmotisk stress ikke påvirker vesicle quantal størrelsen, som definerer antallet nevrotransmitter molekyler lagret i en vesicle kupé på tidligere stadium av utløste exocytosis14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. amperometric målinger av exocytosis utgivelse i enkeltceller, en karbonfiber platen microelectrode er plassert i nær kontakt med celleoverflaten, lage en eksperimentell sett opp mimicking synapse konfigurasjonen, hvor amperometric elektroden fungerer som en postsynaptic detektor (figur 1)22,23. Ved å stimulere en celle til exocytosis, kan en indusere nevrotransmitter-fylte blemmer å fusjonere med plasma cellemembranen og slipp del eller hele vesicle innholdet i den ekstracellulære plassen. Disse nevrotransmitter molekylene utgitt på overflaten av elektroden kan oppdages electrochemically hvis signalstoffer electroactive (f.eks, katekolaminer) ved å bruke et redoks potensial på 700 mV vs en Ag/AgCl referanse elektrode . Derfor en rekke gjeldende toppene merke påvisning av personlige exocytosis hendelser. Fra gjeldende versus tid spor i en amperometric innspillingen, området under hver enkelt amperometric spiss representerer tillegget oppdaget per exocytosis hendelse og kan konverteres til Molo av nevrotransmittere slippes ved å bruke Faraday ligningen. Derfor amperometric opptakene gir kvantitativ informasjon om beløpet nevrotransmittere utvist fra enkelt exocytosis hendelser og rapportere om frekvensen av exocytosis hendelser, men presentere ikke kvantitativ informasjon om sekretoriske blemmer innholdet før vesicle fusion og nevrotransmitter-løslate er startet.

Derfor, for å få en bedre forståelse av hvordan sekretoriske blemmer i cellen cytoplasma svare ekstracellulære osmotisk stress før cellen utløses for å gjennomgå exocytosis, andre komplementære analytiske metoder kan brukes til å berike denne informasjonen. For eksempel, for å undersøke om osmotisk stress endrer vesicle volum, kan overføring elektronmikroskop (TEM) imaging analyse brukes til å måle vesicle størrelsen på cellene etter kjemiske fiksering. For å undersøke om osmotisk stress påvirker vesicle quantal størrelse, en nylig utviklet amperometric teknikk som kalles intracellulær elektrokjemisk cytometri, kan brukes for kvantifisering av vesicle nevrotransmitter innhold på sekretoriske blemmer i deres opprinnelig tilstand når fremdeles bosatt i cytoplasma lever celler26. I intracellulær elektrokjemisk cytometri teknikken, en nanotip sylindriske karbonfiber elektrode forsiktig inn i cytoplasma av levende celler og, ved å bruke en 700 mV potensialet denne elektrode (vs en Ag/AgCl referanse elektrode), den katekolaminer innhold i blemmer kan kvantifiseres ved påvisning av en redoks gjeldende spike fra enkelt blemmer kolliderer, adsorbing, og senere stochastically rupturing på elektroden overflaten, og dermed slippe innholdet mot den elektroden overflaten26. Derfor, i amperometric gjeldende versus tid sporing, hver enkelt vesicle rupturing hendelse kan resultere i en gjeldende forbigående og ved å integrere området av hver gjeldende spiker, vesicle quantal størrelsen kan beregnes Faraday´s lov.

Derfor ved å koble kvantitative opplysningene du får vesicle størrelse mål med TEM bildebehandling med vesicle quantal størrelse analyse, som er registrert av intracellulær elektrokjemisk cytometri, kan vesicle nevrotransmitter konsentrasjon også være bestemt. Dette gjør vesicle karakterisering når celler er utsatt for ulike osmotisk forhold og gir en bedre visning på hvordan blemmer kan svare på ekstracellulære osmotisk stress på scenen før exocytosis. Resultatene fra kombinere disse metodene har vist at i nærvær av ekstracellulære høy osmotisk trykk, blemmer krympe og justere quantal størrelse og sammenligne kvantitativ informasjon om de relative endringene fra disse målingene viser at mens krymper justere blemmer innholdet og størrelse å opprettholde en konstant nevrotransmitter konsentrasjon24. Derfor er denne forståelsen verdifullt i koble til observasjoner på nevrotransmitter utgivelse i celler utsatt for osmotisk stress. I disse protokollene beskrive vi bruken av disse tre komplementære metoder som tillate karakterisering av hvordan sekretoriske blemmer i sine opprinnelige omgivelser svare på ekstracellulære osmolality og effekten av dette svaret på exocytosis prosessen. I tillegg til våre tidligere observasjoner om effekten av høy osmotisk Trykk på exocytosis24presenterer vi flere eksperimenter som beskriver celle utvinning etter osmotisk sjokk og effekten av flere barium stimulations i chromaffin celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cellekultur av bovin Chromaffin celler isolert av enzymatisk fordøyelsen fra binyrene

  1. For å isolere chromaffin celler fra bovine adrenal glands, sterilisere celler med 70% etanol løsning. Klippe bort fett og bindevev ved hjelp av en skalpell. For å fjerne blod, skyll adrenal venene bruker Lockes løsning (NaCl 154 mM, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 5.6 mM ved pH 7.4) som har vært thermostated til 37 ° C.
  2. Å fordøye vevet, blåse hver kjertel ved å injisere ca 2,5 mL av varm sterilt-filtrert 0,2% collagenase P løsning gjennom adrenal åre bruker en sprøyte og ruge vevet etter 20 min på 37 ° C. Undersøke kjertel slik fordøyelsen prosessen med medulla er fullført. Vevet skal føle seg myk og ikke spent.
  3. Samle fordøyd medulla ved å knipe av kjertler i i lengderetningen. Hakke medulla vev ved hjelp av en skalpell. Filtrere vev suspensjon over en stål sil og fortynn med Lockes løsning til ca 50 mL volum å redusere aktiviteten til collagenase P.
  4. Pellets cellene på 300 x g i en centrifuge for 10 min ved romtemperatur og samle inn 50 mL steril reagensglass. Nytt avbryte den fått pellet 20 mL Lockes løsning og filtrere løsningen over en steril 100 µm nylon maske i rør.
  5. Bland chromaffin celle suspensjon med sterilt Percoll (1:1) og sentrifuge celle løsningen 18,600 x g for 20 min ved romtemperatur. Samle det øverste laget av tetthet graderingen og filtrere løsningen over en 100 µm nylon maske i rør.
  6. Hvis du vil utelate Percoll, fortynne celle suspensjon med Lockes løsning og sentrifuge 300 x g for 10 min ved romtemperatur før re suspendere pellet i Lockes løsning. Anslått celle tettheten av isolerte celle suspensjon er ca 4 millioner celler/mL.
  7. Amperometric innspillingen av exocytosis og intracellulær cytometri målinger, plate chromaffin celler i kollagen IV belagt 60 mm plast retter på en tetthet av ca 17,5 × 103 celler/cm2 og ruge cellene på 37 ° C i en 5% CO2 miljø. Utføre den elektrokjemiske eksperimenter innen 1-3 dager med cellekulturer.
  8. For TEM imaging eksperimenter, plate chromaffin celler i 75 cm2 celle kultur flasker på en tetthet av 7-8 millioner celler per kolbe og ruge på 37 ° C i en 5% CO2 miljø for en dag.

2. én celle Exocytosis Amperometry eksperimenter24

  1. For å utvikle karbonfiber microelectrodes for disse eksperimentene, ta et glass kapillær med en ytre diameter egnet for elektrodeholderen på hodet scenen som brukes i disse eksperimentene. Bruk en Borosilikatglass kapillær med en ytre diameter på 1.2 mm og en diameter på 0,69 mm.
    1. Koble én av kapillær slik vann aspirasjon. Plass 5 µm diameter karbon fiber på noe, for eksempel hvitt papir, å forbedre visualisering.
    2. Identifisere en enkelt karbonfiber og hold fiber på ene enden med en finger å holde karbonfiber på plass mens posisjonering den åpne enden av av kapillær i nærheten gratis slutten av karbonfiber. Forsiktig Sug opp karbonfiber inn i glasset kapillær slik at karbonfiber stikker ut gjennom begge ender av av kapillær. Flytt unna aspirasjon kraft.
  2. Plasser av kapillær med karbonfiber i en brønnene avtrekker og trekke glasset kapillær i to separat glass pipette-spisser. Du kobler karbonfiber som er koblet mellom to glass tips, kan du bruke et par saks å kutte karbonfiber og få to karbonfiber microelectrodes.
  3. Under et mikroskop, plassere karbonfiber over en tykkere microscope skyve som tillater manuell kutting av karbonfiber ved der fiber utvider fra glass kapillær belegg ved hjelp av en skalpell.
  4. Etter klipping karbonfiber, etterlot et glass belagt karbonfiber tips, inn noen mm elektrode tips en Epoxy-løsning for 10 min å trekke opp epoksy og forsegle alle mulige åpen plass mellom karbonfiber og rundt glasset. Løft elektrodene sakte ut av epoxy-løsning for å hindre store lim dråper dannes på spissen av elektroden.
  5. Plass elektrodene på en (f.eks, en flat trestav) med to side klissete varmebestandig tape som elektrodene kan festes. Bake epoxy behandlet elektrodene overnatter i en ovn ved 100 ° C. Elektroden tips brytes hvis de kommer i kontakt med en overflate, slik at elektrodene alltid lagres trygt ved hjelp av en holder der elektrodene er fast og tips ikke risikoen blir rørt.
  6. For å få en flat plate elektrode overflate, plasser elektroden i innehaveren av en microgrinder og skråstilt hver karbonfiber elektrode på en engel på 45°. Etter skråkanter, merke av kapillær på sitt dekket med et permanent markør senere vite hvordan du finner platen elektrode overflaten i 45° vinkel når elektroden nær celler for exocytosis måling.
    Merk: Dette trinnet er viktig i disse eksperimentene, ovale plate elektroden må plasseres flatt på celler med dens overflate parallell til overflaten av Petriskål. Også utføres beveling elektroder samme dag som eksperimenter for å sikre en frisk og ren elektrode overflate.
  7. Før bruk, plassere hver karbonfiber microelectrode i en test løsning (f.eks, 0,1 mM dopamin i PBS buffer (pH 7.4)) for å overvåke steady state gjeldende bruker syklisk voltammetry. En syklisk voltammetry skanning, bruke en trekant potensielle bølgeform fra-0.2 V til +0.8 V vs en Ag/AgCl referanse elektrode på 100 mV/s å sikre god reaksjon kinetics data hentes som er enig med teoretisk beregnede verdier for en 5 µm diameter plate karbonfiber microelectrode25.
  8. For amperometry innspillingen av exocytosis, plassere Petriskål kulturperler chromaffin cellene på en invertert mikroskop. Det er viktig å skjerme mikroskopet satt opp med en buret å eliminere elektronisk støy under amperometry opptak, på grunn av lite strøm blir målt. Bruk et mikroskop oppvarming scenen for å opprettholde en temperatur på 37 ° C under cellen eksperimenter.
  9. Bruk en lav støy oppdateringen klemme instrument gjelder et konstant potensial på 700 mV på arbeider elektroden mot en Ag/AgCl referanse elektrode som er også plassert i Petriskål fra arbeider elektroden. For opptak exocytosis chromaffin celler, digital signalet på 10 kHz og bruke en interne low-pass Bessel filteret på 2 kHz filtrere innspilte signalet.
  10. For å utføre amperometric opptak på enkeltceller, montere fersk skrå og testet karbonfiber platen microelectrode i elektrodeholderen av hodet scenen som brukes med potentiostat.
    1. Forsiktig plassere elektroden med den flat ovalt plate figur elektrode overflaten vender ned mot apikale overflaten av cellen og plasser elektroden i kontakt med cellemembranen ved hjelp av en micromanipulator.
    2. Justere avstanden fra elektroden til cellen ved å overvåke celle deformasjon forårsaket av elektroden ved plassering på cellemembranen og så nøye trekke elektroden til en distanse hvor cellen gjenvinner en figur nær sin opprinnelige cellen form . Perfekt for kinetisk og kvantitative innspillingen er å skape en tynn flytende film hundre nanometer skille elektroden og celle overflaten, som er lignende forhold postsynaptic deteksjon av kjemiske utgivelsen i en synapse.
  11. For å stimulere cellene til exocytosis, plassere glass brønnene tips størrelse av 2-3 µm diameter, fylt med 5 mM BaCl2 løsning i en avstand på minst 20 µm fra cellen, å forhindre alle løsning lekker fra pipette spissen å påvirke den eksperimenter og bruker en 5 s injeksjon puls av 5 mM BaCl2 løsning på celleoverflaten å stimulere cellen til exocytosis.
  12. For å studere reversibel effekten av osmotisk Trykk på exocytosis prosessen, forberede en isotonic buffer løsning (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5 mM glukose, 10 mM HEPES, pH 7.4) med 310 mOsm/kg iso-osmotisk trykk og en hypertonic buffer laget ved å justere de NaCl konsentrasjon av isotonic buffer løsning med en osmolality tilsvarer 730 mOsm/kg.
  13. Plasserer cellene i isotonic bufferen og stimulere cellen til exocytosis ved å bruke en barium injeksjon puls under innspillingen amperometric gjeldende transienter under initiert exocytosis aktiviteten for ca 3 min.
    1. For å sammenligne exocytosis svar i isotonic forhold hypertonic forhold, ruge celler for 10 min i hypertonic buffer løsning og deretter bruke en barium injeksjon puls å stimulere exocytosis og utføre 3 min amperometric opptak.
    2. For reversibel responsen av celler, ruge celler igjen for 10 min i isotonic buffer løsning og stimulere celler ved å bruke en 5s barium injeksjon puls og utføre 3 min for innspilling av exocytosis svaret fra cellen.
  14. Kontroll eksperimenter for å bestemme effekten på exocytosis aktivitet ved flere barium stimulations, utfører en amperometric innspillingen av exocytosis utgivelsen fra tre påfølgende BaCl2 stimulations på samme celle plassert i isotonic buffer og bruker samme tid protokoll for påfølgende celle inkubasjon eksperimenter med ulike osmolaritet.

3. intracellulær elektrokjemisk cytometri24,26

  1. For å utvikle elektroder for vesicle quantal størrelse målinger, bruker samme materialer og begynne å forberede en 5 mikrometer i diameter karbonfiber elektrode ifølge beskrivelsen i deler 2.1 og 2.2 av microelectrode fabrikasjon for amperometric exocytosis målinger.
  2. Under et mikroskop, bruk en skalpell for å klippe den karbonfiber utvide av glass spissen slik at en karbonfiber med lengde, fra 30 til 100 µm er igjen stikker ut fra glass spissen.
  3. For å forberede en flamme etset spissen av karbonfiber elektroden, bruk en butan flamme. For å oppnå en jevnt etset, sylindriske formet elektrode tips, hold sylindriske formet karbonfiber elektroden mens rotere det og plassere den karbonfiber utvide fra glass til blå kanten av butan flammen til spissen av karbon utvikler en rød fargen. Dette ofte tar mindre enn 2 s. Hvis dette resulterer i en etset elektrode størrelsen på 50-100 nm i diameter (en SEM bilde av slike tips er vist i figur 5B). Etter flamme etsing, plass elektroden under et mikroskop for å evaluere elektrode spissen.
  4. Sett inn sylindrisk nanotip microelectrode i epoxy løsning for 3 min etterfulgt av en 15 s dipping elektrode tips i en aceton-løsning. Dette gjør at epoxy å forsegle potensielle gapet mellomrommet mellom karbonfiber og isolerende glass kapillær veggen, mens aceton fjerner epoxy av etset karbonfiber elektrode overflaten. For å kurere epoxy, bake elektrodene i en ovn overnatting på 100 ° C.
  5. Før bruk, teste den steady state nåværende hver karbonfiber microelectrode, som forklart i delen 2.7 ved hjelp av syklisk voltammetry. Eksperimenter, bare bruke elektroder som viser et platå gjeldende rundt 1.5-2.5 nA27.
  6. For intercellulære amperometry målinger, plasserer cellene i mikroskopet som beskrevet i 2.8 og bruke samme eksperimentelle innstillingene for potentiostat som beskrevet i 2.9.
  7. Utføre intracellulær amperometric måling og forårsake betydelig fysisk skade cellen inn nanotip sylindrisk microelectrode cellen ved å legge en mild mekanisk kraft, akkurat nok til å presse elektroden gjennom cellen plasma membranen og i cellen cytoplasma ved hjelp av en micromanipulator.
  8. Etter innsetting, og med cellemembranen forseglet rundt sylindriske elektroden, starte amperometric innspillingen på stedet på den levende cellen. På oksidasjon potensielle som brukes til elektroden, blemmer vil adsorberes til elektroden overflaten og stochastically brudd.  Derfor er det ikke behov for noen form for stimulans til å starte denne prosessen.
  9. For å bestemme osmotisk effekten på vesicle quantal størrelse, samle intracellulær cytometri målinger fra en gruppe celler som har blitt ruget isotonic og hypertonic buffer ved hjelp eksperimentelle tilstanden som beskrevet i delen 2.13.

4. dataanalyse Amperometry opptak

  1. Analysere innspilte amperometry dataene fra exocytosis og intracellulær vesicle quantal størrelse analyse, kan du bruke et program som tillater analyse av gjeldende transienter i innspilte gjeldende versus tid sporing så det kinetic peak parametere og integrert totale kostnad for personlige gjeldende topper kan bestemmes. For dataanalyse, har vi brukt programvare utviklet i Sulzer laboratoriet som ble skrevet for data analyseprogrammet Igor28.
  2. Når analysere amperometric toppene, velge en terskel grense for topper tre ganger root-mean square (RMS) standardavvik av støy for hver innspilling.
  3. Samle amperometric toppene fra hver celle innspilling manuelt for å hindre falske pigger som ikke følger Gaussian figuren, dobbel pigger som kan være et resultat av sammenslått exocytosis hendelser og bare akseptere Gaussian formet pigger med en terskel tre ganger høyere enn RMS støy.
  4. Samle data for total kostnad per enkelt amperometric topp og bruke Faradays lov (N = QnF) til å beregne molar mengden katekolaminer nevrotransmitter oppdaget per exocytosis eller intracellulær enkelt vesicle ruptur arrangement, der N er mol av nevrotransmittere går gjennom en redoks reaksjon på elektroden overflaten, Q = totale kostnader oppdaget under hver spiss, n = antall elektroner i redoks reaksjon (n = 2 for katekolaminer), og Faraday´s konstant F = 96485 C/mol.
  5. Utføre statistisk analyse av data samlet inn av første beregning av gjennomsnittlig tillegget oppdaget per hendelse for hver celle. Så hvis avviket mellom celler, beregne gjennomsnittlig tillegget mellom celler og bruke en student t-test mellom celler antar ulik varians. Denne studien brukte programmet MATLAB for statistisk analyse.

5. TEM Imaging for Vesicle størrelse analyse

  1. For å utføre TEM bildebehandling av celler på ulike osmotisk betingelsene, Inkuber første cellene i isotonic eller hypertonic bufferen for 10 min på 37 ° C i en 5% CO2 miljø før kjemiske fiksering av celler.
  2. Utføre celle fiksering bruker Karnovsky etappe, den stabiliserende metoden29. Bruker denne metoden, ruge cellene med en løsning som inneholder 0,01% Natriumazid, 1% formaldehyd og 1,25% glutaraldehyde der utvalget kan lagres på 4 ° C.
  3. Fiksering, vaskes cellene med 0,15 M natrium cacodylate buffer.
  4. Stain cellen prøver post fiksering, og i forberedelse til TEM imaging, ruge cellene med en 1% osmium tetroxide løsning for 2t 4 ° c, etterfulgt av 1t inkubasjon i 0,5% uranyl acetate løsning i romtemperatur i mørket.
  5. På en siste fiksering, mister cellene først skylling cellene i 100% etanol og skyll celler med aceton.
  6. Bygge inn celle prøvene i epoxyresin og deretter utføre sentrifugering 4000 x g for 30-40 minutter og la celle prøve å danner ved 40 ° C i 15t etterfulgt av 48t inkubasjon på 60 ° C.
  7. I forberedelsene til bildebehandling, del celle prøven innebygd i Agar 100 harpiks i skiver med tykkelse på 60 nm ved hjelp av en ultramicrotome.
  8. Underlagt cellene til en 4% uranyl acetate/25% etanol løsning for 4 min etterfulgt av 20 s skylling med vann. Vask cellene med Reynolds bly citrate for 3 min, etterfulgt av 20 s skylling med vann.
  9. Utfør overføring elektronmikroskop bildebehandling av cellen prøver. I vårt forsøk, vi har brukt transmission elektronmikroskop som har vært brukt på 120 kV.
  10. Fra hver registrerte bildet av en celle delen illustrerer den cellen ultrastructure som viser en befolkning av blemmer i cellen cytoplasma, først kalibrere pixel bildestørrelsen ved om piksler baren innspilte skala i hvert TEM bilde. Bruk programvare for å bestemme vesicle størrelsen på hvert bilde celleområde utsatt for isotonisk eller hypertonic forhold. I vårt forsøk brukte vi programvaren ImageJ for bildeanalyser. Det er verdt å merke seg at bildet analyse av mobilnettet ultrastructure av TEM bilder av celler, størrelse justering av disse målingene basert på tykkelsen på cellen deler må vurderes og har tidligere blitt beskrevet av Almers´s lab30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi protokollen for hvordan kombinere TEM bildebehandling med to elektrokjemiske metoder, karbonfiber amperometry og intracellulær elektrokjemisk cytometri, kan gi informasjon som får et bredere syn alluding til effekten av ekstracellulære osmotisk Trykk på sekretoriske blemmer og exocytosis prosessen. Ved å sammenligne representant amperometric opptak av exocytosis utgivelsen på enkelt chromaffin celler ved hjelp av den eksperimentelle satt opp (vist i figur 1), ble en betydelig reduksjon i exocytotic aktivitet vist da celler ble utsatt for osmotisk stress i forhold til celler i isotonic forhold (figur 2A)24. Fra disse opptakene og bruke Faraday´s lov, den totale kostnaden oppdaget av hver individuelle amperometric gjeldende spike ble brukt til å beregne antall molekyler utvist fra enkelt vesicle exocytosis hendelser på celler eksponert på ulike osmotisk forhold. Sammenligning, som vist i figur 2B av mindre området av den gjennomsnittlige amperometric gjeldende oppdaget spike av celler i hypertonic løsning, færre nevrotransmitter molekyler ble løslatt fra hver vesicle av cellene sensing osmotisk stress24 .

For å fastslå Reversibilitet for denne nedgangen i antall nevrotransmitter molekyler utgitt, utført vi amperometric opptak av exocytosis på celler utsatt for et hypertonic miljø og, senere, på cellene etter plassert tilbake i en isotonic miljø. I disse eksperimentene, chromaffin celler ble stimulert tre ganger på rad med BaCl2 løsning: først i en isotonic buffer, etterfulgt av en andre stimulering etter celler var ruges i 10 min i hypertonic løsning og, til slutt, en tredje stimulering etter 10 min celle inkubasjon i isotonic forhold. Resultatene dag som vises i figur 3A at antallet av nevrotransmittere utgitt ble redusert med ~ 50% når celler ble utsatt for hypertonic tilstanden sammenlignet med første Ba2 + stimulering isotonic tilstanden. Senere, når cellene ble brakt til et isotonisk miljø og utsatt for en tredje Ba2 + stimulering, beløpet nevrotransmitter utgitt per exocytosis hendelse ble tilbakeført tilbake til det opprinnelige beløpet innspilt på første stimulering, som bekreftet tidligere observasjoner14. Kontroll eksperimenter med tre påfølgende Ba2 + stimulations celler i isotonic tilstand viser (se figur 3B) at flere sekvensielle Ba2 + stimulations i isotonic forhold ikke endre beløpet nevrotransmitter utgitt under exocytosis. Dette tyder på at vesicle quantal størrelse er raskt og reversibel justert med ekstracellulære osmolaritet.

Men når du analyserer amperometric spor fra disse eksperimentene i form av exocytosis aktivitet, det ble tydelig, som vist i figur 4A, at exocytosis aktiviteten ble betydelig hindret når celler ble utsatt for hypertonic stress. Under osmotisk stress, ble exocytosis hendelser redusert til 12% av aktiviteten på celler i isotonic tilstand. Senere, etter osmotisk sjokk og celler ble plassert tilbake i et isosmotic miljø, gjenvant celler 41% av deres opprinnelige exocytosis. Interessant, kontroll eksperimenter utført i isotonic forhold viste, som vist i figur 4B, at etter utfører tre påfølgende BaCl2 stimulations, frekvensen av exocytosis hendelser ble redusert til 53% etter en andre stimulering og videre ned til 26% av tredje stimulering sammenliknet med første stimulering. Derfor er det klart at påfølgende Ba2 + stimulations ikke synes å påvirke antall nevrotransmittere løslatt fra hver vesicle når exocytosis utløses, men betydelig påvirker effektiviteten av vesicle utgivelsesprosessen.

For å undersøke hvordan sekretoriske blemmer i sine opprinnelige omgivelser påvirkes av ekstracellulære osmotisk stress i vesicle volum eller quantal størrelse, vesicle størrelse analyse med TEM imaging ble kombinert med intracellulære elektrokjemisk cytometri på celler utsatt for isotonisk og hypertonic. Intracellulær elektrokjemisk cytometri eksperimenter, en karbonfiber nanotip elektrode ble satt inn i cytoplasma live chromaffin celler når den plasseres i isotonic og hypertonic løsning (som vist i figur 5.) Den resulterende amperometric gjeldende pigg ble overvåket av hver vesicle i cellen cytoplasma kolliderer, adsorbing, og stochastically rupturing og slippe vesicle innholdet på overflaten av amperometric elektroden ved sprengning26. Integrert totale kostnader gjenkjennes for hver topp i gjeldende versus tid sporing ble brukt til å beregne gjennomsnittlig vesicle quantal størrelsen i hver celle opptak av Faraday´s lov. Disse intracellulær elektrokjemisk cytometri målinger, vist i figur 6 og figur 7B, viste at vesicle quantal størrelsen på celler utsatt for osmotisk stress ble betydelig redusert i forhold til på celler i isotonic forhold. Sammenligne omfanget av endring i vesicle quantal størrelse målt ved intracellulær elektrokjemisk cytometri, fractional nedgangen i antallet nevrotransmitter utgitt under exocytosis på celler opplever ekstracellulære osmotisk stress , viste en relativ reduksjon på 60% både quantal og beløpet nevrotransmitter utgitt sammenlignet på celler i isotonic forhold (figur 7)24. For å relatere justering i vesicle quantal størrelsen til en potensiell variasjon i vesicle nevrotransmitter konsentrasjon av celler opplever osmotisk trykk, ble TEM bildeanalyse gjennomført for å fastslå vesicle størrelsen på cellene isotonic og hypertonic forhold. Videre ble den mørke flekker av tett kjernen protein matrix i LDCVs som er visualisert i TEM bilder som en mørk kule i membranen bundet blemmer brukt til å måle volumet av tett kjernen matrix i disse vesikler. Som presentert i Figur 8, ble vesicle størrelse redusert til 60% på celler utsatt for ekstracellulære osmotisk stress sammenlignet på celler i isotonic forhold. Fra den beregnede mengden målt diameteren på LDCV og tett kjernen, volumet av omkringliggende halo løsningen som vises som en klar løsning innenfor LDCVs i TEM bildene ble også beregnet. Oppsummerte resultater fra TEM bildeanalyse viste som vist i Figur 8, at under ekstracellulære osmotisk sjokk er det hovedsakelig redusert volumet av halo løsning i LDCVs24.

Figure 1
Figur 1 : Enkelt celle exocytosis amperometry. En skjematisk av eksperimentelle satt opp for amperometric måling av exocytosis på én chromaffin celler24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Amperometric spor fra exocytosis målinger.  (A) A representant amperometric innspillingen av exocytosis på chromaffin celler i isotonic (svart farge) og hypertonic (rød farge) ekstracellulære miljøer. (B) utvidelse av en gjennomsnittlig amperometric spike fra exocytosis måling av chromaffin celler i isotonic (svart) og hypertonic (rød) ekstracellulære miljøer24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Reversibilitet antall katekolaminer utgitt på exocytosis etter osmotisk sjokk. (A) antallet molekyler utgitt under exocytosis fra chromaffin celler (n = 4) av tre påfølgende Ba2 + stimulations, med den første stimulering i isotonic, andre i hypertonic, og tredje isotonic buffer. Statistiske resultatene av kortet t-test vises. P -verdien for sammenligning av første Ba2 + stimulering (Ba2 + stim 1) i isotonic buffer med andre Ba2 + stimulering (Ba2 + stim 2) i hypertonic buffer er p= 0.1088 og p-verdi for sammenligning av andre Ba2 + stimulering i hypertonic løsning med den tredje Ba2 + stimulering (Ba2 + stim 3) i isotonic buffer er p = 0.059. (B) kontroll eksperimentet demonstrerer mengden av nevrotransmitter molekyler utgitt på tre påfølgende Ba2 + stimulations chromaffin celler (n = 4) i isotonic buffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Effekten av osmotisk Trykk på exocytosis aktivitet. (A) effekten av ekstracellulære osmolaritet på exocytosis aktiviteten vises som frekvensen av exocytosis hendelser når chromaffin celler (n = 4) stimuleres barium løsning i isotonic og hypertonic, og til slutt i isotonic forhold. Verdiene er presentert som gjennomsnittlig antall toppene fra hver celle og gjennomsnittlig fra alle celler samplet (standard feil av gjsnitt (SEM)). Den statistiske betydningen av endringer er presentert ved hjelp av en t-test kortet data ( p -verdien for isotonisk Ba2 + stimulering 1 og hypertonic Ba2 + stimulering 2 er p= 0.0126 og p-verdien for sammenligning av hypertonic Ba2 + stimulering 2 og isotonic Ba2 + stimulering 3 er p= 0.037). (B) kontroll eksperiment presentere frekvensen av exocytosis hendelser etter tre påfølgende barium stimulations på chromaffin celler (n = 4) i isotonic forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Intracellulær vesicle elektrokjemisk cytometri å overvåke endringer i vesicle quantal størrelse. (A) en skjematisk av den eksperimentelle definere brukes til intracellulær elektrokjemisk cytometri. (B) en skanning elektronmikroskop bilde av en typisk nanotip koniske karbonfiber elektrode24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Intracellulær elektrokjemisk cytometri mål viser (A) representant spor av intracellulær amperometric cytometri opptak på chromaffin celler i isotonic (svart) og hypertonic (rød) ekstracellulære miljøer. (B) utvidelse av en gjennomsnittlig amperometric spike fra intracellulær cytometri måling på chromaffin celler i isotonic (svart) og hypertonic (rød) ekstracellulære miljøer24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Kvantifisering av antall katekolaminer utgitt på exocytosis og fastsettelse av vesicle quantal størrelse. (A) gjennomsnittlig antall molekyler utgitt under exocytosis opptak på chromaffin celler i isotonic (n = 22) og hypertonic (n = 20) miljøer. Verdiene presenteres som en gjennomsnittlig antall molekyler utgitt per exocytosis hendelse fra hver celle og gjennomsnitt av cellene samplet (± SEM). Den statistiske betydningen av endringer presenteres ved hjelp av t-testen for kortet data (p -verdi = 0.0003) (B) gjennomsnittlig antall molekyler per vesicle som oppdages av intracellulær elektrokjemisk cytometri på chromaffin celler i isotonic (n = 19) og hypertonic (n = 16) forhold. Verdiene er presentert som gjennomsnittlig antall molekyler per spike som oppdaget fra hver celle og gjennomsnitt av alle celler samplet (± SEM). Den statistiske betydningen av endringer er presentert ved hjelp av t-testen for kortet data (p - verdi = 0.0108)24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : Effekten av osmotisk Trykk på store tett kjernen vesicle størrelse. Beregnet mengden av LDCVs, tett kjernen protein og halo løsningen rundt tett kjernen protein matrix ble beregnet i attolitres (aL) fra bildeanalyser TEM bilder av chromaffin celler i isotonic (n = 12) og hypertonic (n = 9) buffere. Resultatene ble samlet gjennomsnittlig 311 blemmer per celle og gjennomsnittsverdier enkeltceller (± SEM). P-verdier er rapportert fra kortet t-tester sammenligner isotonic og hypertonic buffere. P-verdi er 0.0385 (*) for vesicle volum, 0.3967 for tett kjernen volum, 0.0047 (*) for halo volum24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer her en protokoll og fordelene ved å kombinere tre komplementære analytiske metoder for å analysere sekretoriske blemmer og exocytosis prosessen for å få en bedre forståelse av hvordan en fysisk makt som osmotiske trykket kan påvirke sekretoriske blemmer og exocytosis prosessen i sekretoriske celler. Disse metodene omfatter karbonfiber microelectrode amperometry, som er en etablert metode for registrering av exocytosis aktivitet, intracellulær elektrokjemisk cytometri, som brukes til å fastsette quantal størrelsen på blemmer i sitt eget miljø, og overføring elektronmikroskop bildeanalyser overvåke sekretoriske vesicle volum. I dette arbeidet ved å samle kvantitative data fra amperometry opptak av enkelt vesicle exocytosis hendelser på chromaffin celler en isotonic og et hypertonic ekstracellulære miljø, vi bekreftet det osmotiske støt reduserer den beløpet nevrotransmittere utgitt under exocytosis og at disse cellene kan reversibel gjenopprette og slipper det opprinnelige antallet, hvis plassert tilbake i et isotonisk miljø (Figur 3).

Amperometric recordings gitt informasjon av exocytosis hendelser versus tid og derfor kan også brukes til å overvåke endringer i exocytosis aktivitet på celler i forskjellige osmotisk miljøer. Disse dataene kan tolkes og brukes til å skjelne om endringer i aktivitet skje umiddelbart eller som en funksjon av tid. Som vi viste i tidligere arbeid, selv om osmotisk stress hemmet exocytotic aktivitet, synes det ikke å hindre blanding av lett releasable bassenget blemmer24. Exocytosis aktivitetsdata kan også brukes til å analysere samlet exocytotic aktiviteten i en periode med opptak. Her presenterer vi Akkumulert antall exocytosis hendelser fra en 3-minutters opptak av exocytosis på chromaffin celler utsatt for de to ulike osmotisk forholdene. Disse dataene viser en hemming exocytosis aktivitet celleområde opplever osmotisk stress og at en delvis utvinning av denne aktiviteten kan oppnås etter celler tilbake til et ekstracellulære isotonic miljø. Men veldig viktig, viste kontroll eksperimenter at flere Ba2 + stimulations innen tidsrammen i disse eksperimentene forårsaket en betydelig reduksjon i exocytosis aktivitet av hver gang en celle ble stimulert til sekret. Tredje påfølgende Ba2 + stimulering, bare en tredjedel av exocytosis aktiviteten ble opprettholdt og tydelig barium, og kanskje også tidspunktet for stimulations i disse forsøkene, var påvirker vesicle syklusen. Dette kan være relevant for å forklare hvorfor exocytotic aktivitet ble gjenopprettet i celler som er plassert i isotonic løsning sjokket osmotisk og hvorfor disse cellene vises en lignende relativ reduksjon i aktiviteten sammenlignet med celler i isotonic forhold etter tre sekvensiell Ba2 + stimulations. Derfor gir amperometry innspillingen av exocytosis informasjon om sekretoriske blemmer fra øyeblikket blemmer utløses for å fusjonere med plasma membranen, slippe nevrotransmittere gjennom fusion pore. Dermed kvantitative data på enkelt vesicle nevrotransmitter slipp og opplysninger på exocytosis aktiviteten kan samles.

Antall nevrotransmitter utgitt kan reguleres av modus av exocytosis som utløses, der enten full vesicle innhold eller deler av innholdet er utgitt. Ved å utelukkende studere exocytosis utgivelse ved hjelp av karbonfiber amperometry som finner bare hva er utvist fra en vesicle, er det vanskelig å skille hvis en endring i oppdaget mengden nevrotransmitter utgitt er knyttet til en endring i utløste modus exocytosis, en endring i mobilnettet Biofysiske egenskaper påvirker vesicle innhold release, eller endringer i vesicle quantal størrelse. Derfor supplerer amperometric innspillingen av exocytosis med mål med intracellulære elektrokjemisk cytometri, i situ målinger av vesicle quantal størrelsen på levende celler kan preget og dermed brukes til å sammenligne den brøkdel av vesicle innhold release fra blemmer under exocytosis26.

I dette arbeidet, for å undersøke om vesicle quantal størrelsen var påvirket av osmotisk stress, brukt vi denne teknikken for kvantifisering og evaluering av vesicle quantal størrelsen på celler utsatt for isotonisk og hypertonic forhold. Innsetting av nanotip elektroden cytoplasm i en levende celle er regnet ganske invasiv, disse eksperimentene var bare utføres én gang per celle og var ikke gjentatt på den samme cellen. Disse eksperimentene utføres derfor fortrinnsvis som enkeltmål fra grupper av tilfeldig valgte celler en isotonic og et hypertonic ekstracellulære miljø. Sammenligne endringer i vesicle quantal størrelse målt ved intracellulær elektrokjemisk cytometri til endringer i beløp nevrotransmitter utgitt på exocytosis, bør man vurdere matchende eksperimentelle forhold intracellulær opptak og Utfør amperometry innspillingen av exocytosis på separate tilfeldig celler. Hvis studier utføres på samme enkelt celle, er det viktig i disse eksperimentelle protokollene også vurdere påvirkning av påfølgende BaCl2 stimulations, og sikre eksperimentelle forhold samsvarer med de som brukes for intracellulær cytometri målinger. Det er også verdt å merke seg at det er vanskelig å kontrollere nøyaktig plassering og dybden av elektroden når settes inn i en celle. Dermed gir hver celle et tilfeldig utvalg for vesicle quantal størrelse analyse. I tillegg undersøkelser vesicle quantal størrelse ved hjelp av denne metoden skiller ikke forskjeller i, for eksempel vesicle modenhet og derfor også kan legge variasjon til målinger. Intracellulær viste at vesicle quantal størrelse var redusert til celler utsatt for ekstracellulære osmotisk trykk. Den relative reduksjonen i quantal størrelse oppdaget av denne metoden ble sammenlignet med observasjoner av relativ endringer i nevrotransmitter utgivelsen i exocytosis. Denne studien fant at den relative tilbakegang i quantal størrelse var i den samme ordren som fall i nevrotransmitter utgivelsen på celler sensing osmotisk stress.

Å bekrefte hvis osmotisk stress ble endre vesicle nevrotransmitter konsentrasjonen, vesicle volumet ble evaluert med TEM imaging analyse for kjemisk fast chromaffin celler som hadde vært utsatt for isotonisk og hypertonic. TEM imaging analyse viste at blemmer krympe når celler er utsatt for en osmotisk sjokk og at den relative reduksjonen i størrelsen justeres med vesicle quantal størrelsen å opprettholde en konstant nevrotransmitter konsentrasjon24. Bildeanalyse TEM, som gir nanometer bildeoppløsningen kan skille de to faser, tett kjernen protein matrix og omkringliggende halo løsningen i LDCVs, og dermed gjør det mulig å fastslå volumet av tett kjernen protein matrise og beregne volumet av halo løsningen. Fra denne analysen identifiserte nedgangen i vesicle volumet å være hovedsakelig relatert til en avtagende volum fra halo løsning rundt tett kjernen protein matrix24.

I sammendraget, denne studien presenterer en protokoll demonstrere hvordan tre analytiske metoder kombineres, og lar karakteristikk av sekretoriske blemmer før nevrotransmitter utgivelsen, og hva er løslatt fra disse vesikler når celler utløses til exocytosis, å få en bedre forståelse av hvordan sekretoriske blemmer og celle funksjoner som exocytosis påvirkes av ekstracellulære stress. Denne protokollen kan også brukes til å svare på spørsmål på hvordan nevrotransmitter løslate for exocytosis og vesicle quantal størrelse påvirkes av andre endringer i det fysiske miljøet eller potensielle stoffer som kan påvirke sekretoriske celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke den svenske Research Council (349-2007-8680) for finansiering og Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Sverige) for donasjon av bovin binyrene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma Aldrich S7653
KCl Sigma Aldrich P9333
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
MgCl2 Sigma Aldrich M-2670
Glucose Sigma Aldrich G8270
Collagenase P Roche, Sweden 11 213 857 001
100-µM Nylon mesh Fisher Sientific 08-771-19
Percoll Sigma Aldrich P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish VWR 354416
Centrifuge Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller Narishing Inc., Japan PE-21
Epoxy solutions (A and B) Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller Narishing Inc. EG-400
Inverted Microscope Olympus IX81
Patch clamp Instrument Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200B
Micromanipulator Burleigh Instrument Inc., USA PCS-5000
Butane Flame Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy Omega Leo 912 AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

Tags

Nevrovitenskap problemet 132 Chromaffin celler osmotisk trykk tett kjernen blemmer nevrotransmitter konsentrasjon quantal størrelse exocytosis amperometry intracellulær cytometri overføring elektronmikroskop
Overvåke effekten av osmotisk Stress på sekretoriske blemmer og Exocytosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi,… More

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. S. Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis. J. Vis. Exp. (132), e56537, doi:10.3791/56537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter