Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Övervaka effekten av osmotisk Stress på sekretoriska vesikler och exocytos

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56537
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Summary

Osmotisk stress påverkar exocytos och mängden signalsubstans släppt under denna process. Vi visar hur kombinera elektrokemiska metoder tillsammans med transmissionselektronmikroskopi kan användas för att studera effekten av extracellulära osmotiska trycket på exocytos aktivitet, vesikler kvantfysikaliska storlek och mängden signalsubstans släppt under exocytos.

Abstract

Amperometry inspelning av celler utsätts för osmotiska chock visar att sekretoriska celler svarar på denna fysiska stress genom att minska aktiviteten exocytos och mängden signalsubstans som släppt från blåsor i enda exocytos händelser. Det har föreslagits att minskningen av signalsubstanser utvisas beror på förändringar i membran biofysiska egenskaper när celler krympa svar på osmotisk stress och med antaganden som sekretoriska vesikler i cellens cytoplasma påverkas inte av extracellulära osmotisk stress. Amperometry inspelning av exocytos övervakar vad frisätts från cellerna nu en vesikel säkringar med plasmamembranet, men ger inte information om vesikler innehållet innan vesikler fusion utlöses. Därför, genom att kombinera amperometry inspelning med andra kompletterande analytiska metoder som kan karaktärisera de sekretoriska vesikler innan exocytos vid celler utlöses erbjuder en bredare överblick för att pröva hur sekretoriska vesikler och exocytos processen påverkas av osmotiska chock. Här beskriver vi hur kompletterar amperometry inspelning med intracellulära elektrokemiska flödescytometri och överföring elektronmikroskopi (TEM) imaging kan användas för att karaktärisera förändringar i sekretoriska vesikler storlek och signalsubstansen innehåll på chromaffin celler i förhållande till exocytos verksamhet före och efter exponering för osmotisk stress. Genom att länka den kvantitativa informationen från experiment med alla tre analytiska metoder, gjorts slutsatser tidigare att sekretoriska vesikler svarar på extracellulära osmotisk stress genom minskat i storlek och minska vesikler kvantfysikaliska storlek till upprätthålla en konstant vesikler neurotransmittorn koncentration. Detta ger därför ett förtydligande angående varför blåsor, som svar på osmotisk stress, minska mängden neurotransmittorer frigörs vid exocytos release. Amperometrisk inspelningarna här tyder detta en reversibel process och att vesikler efter osmotiska chock är återfyllas med signalsubstanser när placerade celler återställs till en isoton miljö.

Introduction

Chromaffin celler i binjurarna är neuroendokrina celler som frigör signalsubstansen molekyler i blodet. Detta sker genom en cellulär process som involverar dockning och fusion av signalsubstansen-fyllda blåsor, vilket resulterar i innehåll frigörare från blåsor till det extracellulära utrymmet i en process som kallas exocytos. Signalsubstanserna (adrenalin och noradrenalin) i chromaffin celler är aktivt transporteras av membranproteiner in stora tät kärna blåsor (LDCVs) och lagras vid höga koncentrationer (~0.5-1 M)1,2. Ackumulering av neurotransmittorer inuti LDCVs åstadkoms av katekolamin molekyler affinitet till intravesicular tät kärna protein matrix består av chromogranin proteiner (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, och en intravesicular cocktail lösning som innehåller viktiga komponenter för katekolamin lastning och lagring i vesikler som ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM i lösning och ~ 40 mM bunden till den protein matrix)8Mg2 + (5 mM)9, askorbat (10-30 mM)10och ett pH på ~5.511,12. LDCVs bibehålla en isoosmotisk tillstånd med cell cytoplasman (310 mOsm/kg)13, även om den teoretiska lösningens koncentrationen inuti blåsor summera upp till mer än 750 mM. Sammansättningen av intravesicular komponenter är inte bara viktigt för lastning och lagring av katekolaminer, men också för aggregering av koncentrationsfördelningen till tät kärna protein matrix. Vilket avsevärt minskar blåsor osmolaritet minskas avsevärt och kan påverka de belopp katekolamin som frigörs under exocytos5,6.

Studier på effekten av extracellulära osmotiska trycket på processen exocytos av amperometrisk inspelning har rapporterat att höga extracellulära osmotiska trycket hämmar exocytos aktivitet och minskar antalet neurotransmittorer som utsöndras från singel vesikler fack4,14,15,16,17,18,19. Förklaringar av dessa observationer har spekulerat om möjligt förbättrande av makromolekylära trängs i cell cytoplasman hämmande vesikler fusion händelserna, och en förändring i membran biofysiska egenskaper som påverkar antalet neurotransmittorer frigörs vid exocytos. Dessa tankar antas att höga extracellulära osmotisk stress inte påverkar vesikler kvantfysikaliska storlek, som definierar antalet signalsubstansen molekyler lagras i vesikler kupé i tidigare skede av utlösta exocytos14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. i amperometrisk mätningar av exocytos release i enstaka celler, en kolfiber skiva mikroelektrod placeras i nära kontakt med cellytan, skapa en experimentell uppsättning upp härma synaps konfiguration, där amperometrisk elektroden fungerar som en postsynaptiska detektor (figur 1)22,23. Genom att stimulera en cell till exocytos, förmå en neurotransmittor-fyllda blåsor till säkring med plasma cellmembranet och släppa en del eller hela vesikler innehållet i det extracellulära utrymmet. Dessa signalsubstansen molekyler släppt på ytan av elektroden kan upptäckas elektrokemiskt om signalsubstanser är elektroaktiva (t.ex., katekolaminer) genom att tillämpa en redoxpotential av +700 mV vs en referenselektrod av Ag/Granulatfyllda . Följaktligen, markera en rad aktuella spikar detektion av enskilda exocytos händelser. Från nuvarande kontra tid spår i en amperometrisk inspelning, området under varje enskild amperometrisk spike representerar den avgift som upptäckts per exocytos händelse och kan omvandlas till Mullvaden av signalsubstanser som släppt, med hjälp av Faraday ekvation. Därför amperometrisk inspelningarna ger kvantitativ information om mängden signalsubstanser utvisas från enda exocytos händelser och rapportera om frekvensen av exocytos händelser, men innebär inte kvantitativa uppgifter om de sekretoriska vesikler innehåll tidigare vesikler fusion och neurotransmitterfrigöraren har inletts.

Därför, för att få en bättre förståelse för hur sekretoriska vesikler i cellen cytoplasman svara på extracellulära osmotisk stress innan cellen utlöses för att genomgå exocytos, andra kompletterande analytiska metoder kan användas för att berika denna information. Exempelvis för att undersöka om osmotisk stress förändrar vesikler volym, kan transmissionselektronmikroskopi (TEM) imaging analys användas att mäta vesikler storleken på celler efter kemiska fixering. För att undersöka om osmotisk stress påverkar vesikler kvantfysikaliska storlek, en nyligen utvecklad amperometrisk teknik som kallas intracellulära elektrokemiska flödescytometri, kan tillämpas för kvantifiering av vesikler signalsubstansen innehåll på sekretoriska vesikler i deras infödda tillstånd när fortfarande är bosatta i cytoplasman i levande celler26. I den intracellulära elektrokemiska flödescytometri tekniken, en nanotip cylindriska kolfiber elektrod infogas försiktigt i cytoplasman av levande celler och, genom att tillämpa en +700 mV-potential till denna elektrod (vs en Ag/Granulatfyllda referens elektrod), den katekolamin innehåll i blåsor kan kvantifieras genom påvisande av en redox nuvarande spike från enstaka blåsor kollidera, absorberande, och därefter stochastically spricker vid elektrod ytan och därmed släppa deras innehåll mot den elektrod ytan26. Därav, i amperometrisk nuvarande kontra tid spårning, varje enstaka vesikel spricker händelse kan resultera i en nuvarande övergående och genom att integrera området i varje nuvarande spike, vesikler kvantfysikaliska storlek kan beräknas med Faraday´s lag.

Därför, genom att länka den kvantitativa informationen från vesikler storlek mätningar med TEM imaging tillsammans med vesikler kvantfysikaliska storlek analys, som registrerats av intracellulära elektrokemiska flödescytometri, vesikler neurotransmittorn koncentration kan också bestämmas. Detta tillåter vesikler karakterisering när celler utsätts för olika osmotiska förhållanden och ger en bättre överblick på hur blåsor kan svarar på extracellulära osmotisk stress i skedet före exocytos. Resultaten från att kombinera dessa metoder har visat att närvaro av extracellulära höga osmotiska trycket, blåsor krympa och justera deras kvantfysikaliska storlek och jämföra den kvantitativa uppgifter om de relativa förändringarna av dessa mätningar visar att samtidigt krymper justera blåsor deras innehåll och storlek att upprätthålla en konstant neurotransmittorn koncentration24. Denna förståelse är alltså värdefullt i anslutning till de iakttagelser som gjorts på neurotransmitterfrigöraren i celler utsätts för osmotisk stress. I protokollen beskriver vi användning av dessa tre kompletterande metoder som tillåter karakterisering av hur sekretoriska vesikler i deras infödda miljö besvara extracellulär osmolalitet och effekterna av detta svar på exocytos processen. Förutom våra tidigare iakttagelser angående effekten av höga osmotiska trycket på exocytos24presenterar vi ytterligare experiment som beskriver cellen återhämtning efter osmotiska chock och effekten av flera barium stimuli i chromaffin celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cellkultur för nötkreatur Chromaffin celler som isolerats genom enzymatisk nedbrytning från binjurarna

  1. För att isolera chromaffin celler som samlats in från nötkreatur binjurarna, sterilisera du celler med 70% etanol lösningen. Putsa bort fett och bindväv med en skalpell. Ta bort blod, skölj adrenal venerna med Lockes lösning (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, hydroxietylstärkelse piperazineethanesulfonic syra (HEPES) 5,6 mM vid pH 7,4) som har varit Termostatstyrt till 37 ° C.
  2. Att smälta vävnaden, blåsa upp varje körtel genom att injicera cirka 2,5 mL varm steril-filtrerad 0,2% kollagenas P lösning genom binjurarna med en spruta och inkubera vävnaden under 20 minuter vid 37 ° C. Undersöka körtlarna för att säkerställa rötningsprocessen av medulla är avslutat. Vävnaden ska kännas mjuk och inte spänd.
  3. Samla smält medulla genom snipping bort körtlarna i längsgående riktning. Finhacka den medulla vävnaden med en skalpell. Filtrera vävnad suspensionen över en stål sil och späd med Lockes lösning till ungefär en 50 mL volym att minska aktiviteten av kollagenas s.
  4. Pellet cellerna vid 300 x g i en centrifug 10 min i rumstemperatur och samla in 50 mL sterilt provrör. Re centrifugerade erhållna i 20 mL Lockes lösning och filtrera lösningen över en steril 100 µm nylon mesh in rören.
  5. Blanda chromaffin cellsuspension med sterila Percoll (1:1) och centrifugera cell lösningen vid 18,600 x g i 20 min i rumstemperatur. Samla det översta lagret av täthetlutningen och filtrera lösningen över en 100 µm nylon mesh in rören.
  6. För att utesluta Percoll, späd cellsuspension med Lockes lösning och centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid rumstemperatur innan vi åter avbryter pelleten i Lockes lösning. Uppskattade cell densiteten av isolerade cellsuspensionen är cirka 4 miljoner celler/mL.
  7. För amperometrisk inspelning av exocytos och intracellulär flödescytometri mätningar, plattan chromaffin celler i kollagen IV belagda 60 mm plast rätter med en täthet av ca 17,5 × 103 celler/cm2 och inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 miljö. Utföra de elektrokemiska experiment inom 1-3 dagar i cellkultur.
  8. För TEM imaging experiment, plattan chromaffin celler i 75 cm2 cell kultur kolvar med en täthet av 7-8 miljoner celler per kolv och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 miljö för 1 dag.

2. enstaka Cell exocytos Amperometry experiment24

  1. För att fabricera kolfiber mikroelektroder för dessa experiment, ta ett glas kapillär med en yttre diameter som lämpar sig för elektrodhållare skede huvud som ska användas i dessa experiment. Använda en borosilikatglas kapillär med en yttre diameter på 1,2 mm och en inre diameter på 0.69 mm.
    1. Anslut en av kapillär ändar till ett vatten aspiration rör. Placera 5 µm diameter kolfibrer på något, som en bit av vitboken, att förbättra visualisering.
    2. Identifiera en enda kolfiber och håller fibern ner ena änden med ett finger för att hålla kolfiber på plats medan positionering den öppna änden av kapillären i närhet till fria ände i kolfiber. Aspirera försiktigt kolfiber i glaset kapillär så att kolfiber sticker ut genom båda ändarna av kapillären. Flytta bort den aspiration kraften.
  2. Placera kapillären med carbon fiber i en mikropipett avdragare och dra glaset kapillär i två separata glas pipettspetsar. Om du vill koppla i kolfiber som är ansluten mellan två glas tips, använder du ett par sax att klippa i kolfiber och få två kolfiber mikroelektroder.
  3. I Mikroskop, placera kolfiber ovanpå ett tjockare objektglas som tillåter manuell skärning av carbon fiber vid kanten av där fibern sträcker sig från glas kapillär beläggning med en skalpell.
  4. Efter styckning i kolfiber, lämnar en glas belagd kolfiber spets, infoga några mm elektrod spets i en epoxi lösning för 10 min att dra upp epoxi och försegla alla möjliga öppet utrymme mellan kolfiber och omgivande glas. Lyft elektroderna försiktigt ut epoxi lösningen för att förhindra skrymmande lim droppar bildas på spetsen av elektroden.
  5. Placera elektroderna på en hållare (t.ex., en platt träpinne) med två-sida värmetålig tejp som elektroder kan fästas. Baka epoxy behandlad elektroderna över natten i en ugn vid 100 ° C. Elektroden tips lätt bryta om de kommer i kontakt med en yta, så se till att elektroderna alltid lagras på ett säkert sätt med hjälp av en hållare där elektroderna fixas på plats och tips inte riskerar att bli rörd.
  6. För att få en plan skiva elektrod ytan, placera elektroden i innehavaren av en microgrinder och kantskär varje kolfiber elektrod vid en ängel av 45°. Efter fasning, markera kapillären på dess ovansida med en permanent markörpenna senare veta hur att hitta skivan elektrod ytan i 45° vinkel när du placerar elektroden nära celler för exocytos mätning.
    Obs: Detta steg är viktigt i dessa experiment, oval skiva elektroden behöver placeras platt ovanpå celler med dess ytbehandlar parallell till ytan av petriskål. Dessutom görs beveling elektroder samma dag som experiment för att säkerställa en frisk och ren elektrod ytan.
  7. Före användning, placera varje kolfiber mikroelektrod i en provlösning (t.ex., 0,1 mM dopamin i PBS-bufferten (pH 7,4)) för att övervaka steady state nuvarande använder cyklisk voltametri. För en cyklisk voltametri scan, applicera en triangel potentiella vågform från -0,2 V till + 0,8 V vs en referenselektrod av Ag/Granulatfyllda på 100 mV/s att säkerställa bra reaktion kineticsen uppgifter erhålls som är överens med teoretiskt beräknade värden för en skiva med 5 µm i diameter kolfiber mikroelektrod25.
  8. För amperometry inspelning av exocytos, placera petriskål med odlade chromaffin cellerna på ett inverterat Mikroskop. Det är viktigt att skydda mikroskopet ställa upp med en Faradays bur att undanröja elektroniskt brus under den amperometry inspelning, på grund av de mycket små strömmar som mäts. Använda Mikroskop värmebord för att hålla en temperatur av 37 ° C under cell experimenten.
  9. Använda ett lågt brus patch clamp instrument för att tillämpa en konstant potential av +700 mV vid arbetselektroden kontra en referenselektrod av Ag/Granulatfyllda som placeras också i petriskål från arbetselektroden. För inspelning exocytos av chromaffin celler, digitalisera signalen vid 10 kHz och tillämpa en intern lågpass Bessel-filtret på 2 kHz att filtrera inspelade signalen.
  10. För att utföra amperometrisk inspelning på enstaka celler, montera den nybakade avfasade och testade kolfiber skiva mikroelektrod i elektrodhållare huvud scenen som används med potentiostaten.
    1. Försiktigt placera elektroden med platt oval skiva form elektrod riktad mot den apikala ytan av cellen och placera elektroden i kontakt med cellmembranet med hjälp av en micromanipulator.
    2. Justera avståndet från elektroden till cellen genom övervakning cell deformationen orsakas av elektroden vid placering ovanpå cellmembranet och sedan försiktigt dra in elektroden till ett avstånd där cellen återfår formen nära sin ursprungliga cellen form . Perfekt för kinetiska och kvantitativa inspelning är att skapa en tunn vätskefilm hundra nanometer till separata elektrod och cell ytan, som är liknande villkor för postsynaptiska upptäckt av kemiska release i en synaps.
  11. För att stimulera cellerna att exocytos, placera ett glas mikropipett med en storlek av 2-3 µm i diameter, fyllt med 5 mM BaCl2 lösning på ett avstånd av minst 20 µm från cellen, för att förhindra någon lösning som läcker från pipettspetsen att påverka den experimentera och tillämpa en 5 s injektion puls av 5 mM BaCl2 lösning på cellytan att stimulera cellen till exocytos.
  12. För att studera de reversibla effekterna av osmotiska trycket på processen exocytos, förbereda en isoton buffertlösning (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 5 mM glukos, 10 mM HEPES, pH 7,4) med 310 mOsm/kg iso-osmotiska trycket och en hyperton buffert gjort genom att justera den NaCl koncentrationen av isoton buffertlösningen med en osmolalitet motsvarande 730 mOsm/kg.
  13. Placera cellerna i isoton bufferten och stimulera cellen till exocytos genom att tillämpa en barium injektion puls medan du spelar in de amperometrisk nuvarande transienter under initierade exocytos aktiviteten under ca 3 minuter.
    1. För att jämföra exocytos svaren i isoton villkor på hyperton villkor, inkubera cellerna för 10 min i hyperton buffertlösning och därefter tillämpa en barium injektion puls för att stimulera exocytos och utföra 3 min av amperometrisk inspelning.
    2. För reversibla svar av celler, inkubera cellerna igen i 10 min i isoton buffertlösning och stimulera celler genom att tillämpa en 5s barium injektion puls och utföra 3 minuters inspelning exocytos svaret från cellen.
  14. Kontroll-experiment för att fastställa effekten på exocytos aktivitet av flera barium stimuli, utföra en amperometrisk inspelning av exocytos release från tre på varandra följande BaCl2 stimuli på samma cell placeras i isoton buffert och använda samma tid protokoll för på varandra följande cell inkubation experiment med olika osmolaritet.

3. intracellulära elektrokemiska flödescytometri24,26

  1. För att fabricera elektroder för vesikler kvantfysikaliska storlek mätningar, använda samma material och börja förbereda en 5 µm i diameter kolfiber elektroden enligt beskrivningarna i avsnitt 2.1 och 2.2 i mikroelektrod fabrication för amperometrisk exocytos mätningar.
  2. I Mikroskop, använda en skalpell skära den kolfiber förlängning av glas spetsen så att en kolfiber med en längd mellan 30 till 100 µm är kvar sticker ut från glas spets.
  3. För att förbereda en flamma etsad spets av kolfiber elektroden, använda butan flamma. För att uppnå ett jämnt etsade, cylindriska formade elektrod tips, håll cylindriska formade kolfiber elektroden samtidigt vrida den och placera den kolfiber sträcker sig från glaset in i blå kanten av butan lågan tills spetsen av kol utvecklar en röd färg. Detta tar ofta mindre än 2 s. Om det lyckas, resulterar detta i en etsad elektrod storlek 50-100 nm i diameter (en SEM-bild av sådana tips visas i figur 5B). Efter flamma etsning, placera elektroden i Mikroskop för att utvärdera elektrod spetsen.
  4. Infoga den cylindriska nanotip mikroelektrod i epoxi lösning för 3 min följt av en 15 s doppning av elektroden spetsen i en aceton-lösning. Detta tillåter epoxi att försegla potentiella gap utrymmet mellan kolfiber och isolerande glas kapillär väggen, medan aceton rensar epoxin från etsade kolfiber elektrod ytan. För att bota epoxi, baka elektroderna i ugn över natten vid 100 ° C.
  5. Före användning, testa steady-state strömmen av varje kolfiber mikroelektrod, som förklaras i avsnitt 2.7 använda cyklisk voltametri. För experiment, bara använda elektroder som visar en platå nuvarande runt 1.5-2.5 nA27.
  6. Intercellulära amperometry mätningar, placera cellerna på mikroskopet som beskrivs i 2,8 och använda samma experimentella inställningarna för potentiostaten som beskrivs i 2,9.
  7. Att utföra mätning av intracellulära amperometrisk, och för att förhindra betydande fysiska skador på cellen, infoga den nanotip cylindriska mikroelektrod i cellen genom att lägga till en mild mekanisk kraft, bara tillräckligt för att driva elektroden genom cellplasmaet membranet och in i cellens cytoplasma med en micromanipulator.
  8. Efter införande, och med cellmembranet förseglas runt cylindriska elektroden, starta amperometrisk inspelningen på plats vid den levande cellen. Vid oxidation potential som tillämpas på elektroden, blåsor kommer att adsorbera till elektrod ytan och stochastically brista.  Därför finns det inget behov av någon form av stimulans att inleda denna process.
  9. För att avgöra den osmotiska effekten på vesikler kvantfysikaliska storlek, samla intracellulär flödescytometri mätningarna från en grupp av celler som har inkuberats i isoton och hyperton buffert med experimentella villkoret som beskrivs i avsnitt 2.13.

4. analys av Amperometry Recordings

  1. För att analysera den inspelade amperometry datan från exocytos och intracellulära vesikler kvantfysikaliska storlek analys, använda ett program som möjliggör analys av nuvarande transienter i den inspelade nuvarande kontra tid spår så att kinetiska peak parametrar och integrerad totala kostnad för enskilda strömtoppar kan bestämmas. För analys av data, har vi använt mjukvara utvecklad i Sulzer labbet som skrevs för data analys programmet Igor28.
  2. När analysera amperometrisk spikar, Välj en tröskelvärdet gräns för topparna av tre gånger root-mean square (RMS) standardavvikelsen av buller för varje inspelning.
  3. Samla in amperometrisk spikar från varje cell inspelning manuellt för att förhindra falska spikar som inte följer Gaussisk form, dubbel spikar som kan vara resultatet av sammanslagna exocytos händelser, och bara acceptera Gaussisk formade spikar med ett tröskelvärde på tre gånger högre än RMS buller.
  4. Samla data för totala kostnad per enskild amperometrisk topp och använda Faradays lag (N = QnF) att beräkna molar katekolamin signalsubstansen upptäckts per exocytos eller intracellulära enstaka vesikel bristning händelse, där N är mol av signalsubstanser som går igenom en redox reaktion på elektrod ytan, Q = den totala avgiften som upptäckts under varje spike, n = antalet elektroner överförs i redox reaktion (n = 2 för katekolaminer), och den Faraday´s konstant F = 96485 C/mol.
  5. Utföra statistiska analyser av data som samlas in av första beräkning av den genomsnittliga avgift som upptäckts per händelse för varje cell. Sedan för variansen mellan celler, beräkna den genomsnittliga laddningen mellan celler och använder en students t-test mellan celler antar olika varians. Denna studie använde programmet MATLAB för statistisk analys.

5. TEM Imaging för vesikler storlek analys

  1. För att utföra TEM imaging av celler vid olika osmotiska villkoren, först Inkubera cellerna i isoton eller hyperton buffert under 10 minuter vid 37 ° C i en 5% CO2 miljö innan kemiska fixering av celler.
  2. Utföra cell fixering med hjälp av Karnovsky fixativ metod29. Med den här metoden, inkubera cellerna med en lösning innehållande 0,01% natriumazid, 1% formaldehyd och 1,25% glutaraldehyd där provet kan lagras vid 4 ° C.
  3. Efter fixering, tvätta cellerna med 0,15 M natrium cacodylate buffert.
  4. För att färga cellen prover bokför fixering och förberedelse för TEM imaging, inkubera cellerna med en 1% osmium vanligtvis lösning för 2 h vid 4 ° C, följt av 1 h inkubation i 0,5% uranyl Acetat lösning vid rumstemperatur i mörkret.
  5. I ett sista fixering steg, torka cellerna först genom att skölja cellerna i 100% etanol och skölj sedan celler med aceton.
  6. Bädda in cellprover i epoxyresin och därefter utföra centrifugering vid 4000 x g i 30-40 min och tillåta cell provet att polymerisera vid 40 ° C i 15 h följt av 48 h inkubation vid 60 ° C.
  7. Förberedelse för imaging, avsnitt cell provet inbäddad i Agar 100 harts i skivor med tjocklek 60 nm med en ultramicrotome.
  8. Utsätta celler för en 4% uranyl acetate/25% etanol lösning för 4 min följt av 20 s av sköljning med vatten. Tvätta cellerna med Reynolds bly citrat för 3 min, följt av 20 s av sköljning med vatten.
  9. Utföra överföring elektronmikroskopi imaging av cellprover. I vårt experiment, har vi använt ett transmissionselektronmikroskop som har använts vid 120 kV.
  10. Från varje inspelad bild av en cell avsnitt illustrerar den cell ultrastruktur som visar en befolkning av blåsor i cellens cytoplasma, först kalibrera bilden pixelstorlek genom att relatera pixlar till inspelade skalstapeln i varje TEM bild. Använd avbildningsprogrammet för att avgöra vesikler storlekarna på varje bild av celler utsätts för isoton eller hyperton villkor. I våra försök har använt vi programmet ImageJ för bildanalys. Det är värt att notera att för bildanalys av cellulära ultrastruktur från TEM bilder av celler, storlek justering av dessa mätningar baserat på tjockleken på cell sektioner måste betraktas och tidigare har beskrivits av Almers´s lab30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi beskriver här protokollet för hur kombinera TEM imaging tillsammans med två elektrokemiska metoder, kolfiber amperometry och intracellulära elektrokemiska flödescytometri, kan ge information som når en bredare syn som anspelar på effekten av extracellulära osmotiska trycket på sekretoriska vesikler och processen exocytos. Genom att jämföra representativa amperometrisk inspelningar av exocytos release på enstaka chromaffin celler använder den experimentella ställa in (visas i figur 1), visades en betydande minskning av exocytotic verksamhet när celler utsattes för osmotisk stress jämfört med celler i isoton förhållanden (figur 2A)24. Från dessa inspelningar och med hjälp av Faraday´s lag, den totala avgiften upptäcks av varje enskild amperometrisk nuvarande spike användes för att beräkna antalet molekyler som utvisas från enstaka vesikel exocytos evenemang på celler utsätts för de olika osmotiska villkor. I jämförelse, som visas i figur 2B av mindre området av den genomsnittliga amperometrisk nuvarande upptäcks spike av celler i hyperton lösning, färre signalsubstansen molekyler släpptes från varje vesikler av celler avkänning osmotisk stress24 .

För att avgöra reversibiliteten av denna nedgång i antalet signalsubstansen molekyler släppt, utfört vi amperometrisk inspelningar av exocytos vid celler utsätts för en hyperton miljö och därefter vid celler efter läggs tillbaka i en isotonisk miljö. I dessa experiment, chromaffin celler stimuleras tre gånger i följd med BaCl2 lösning: först i en isotonisk buffert, följt av en andra stimulering efter celler inkuberades i 10 min i en hyperton lösning och slutligen en tredje stimulering efter 10 min cell inkubation i isoton villkor. Resultaten närvarande som visas i figur 3A att mängden signalsubstanser släppt sänktes med ~ 50% när celler utsattes för villkoret hyperton jämfört med den första Ba2 + stimuleringen i isoton skick. Därefter, när celler fördes tillbaka till en isoton miljö och utsätts för en tredje Ba2 + stimulering, belopp signalsubstansen släppte per exocytos händelse vände tillbaka till det ursprungliga beloppet registreras vid den första stimuleringen, som bekräftade tidigare observationer14. Kontroll experiment med tre successiva Ba2 + stimuli av celler i isoton skick visar (se figur 3B) att flera sekventiella Ba2 + stimuli i isoton villkor inte förändrade beloppet signalsubstansen släppt under exocytos. Detta tyder på att vesikler kvantfysikaliska storlek justeras snabbt och reversibelt med extracellulära osmolaritet.

När man analyserar amperometrisk spåren från dessa experiment i termer av exocytos aktivitet, blev det dock tydligt, som visas i figur 4A, exocytos aktiviteten hämmades avsevärt när celler utsattes för hyperton stress. Under osmotisk stress reducerades exocytos händelser till 12% av aktiviteten på celler i isoton skick. Därefter, efter den osmotiska chock och celler placerades tillbaka in i en isosmotic miljö, återfick celler 41% av deras ursprungliga exocytos verksamhet. Intressant, kontroll experimenten utförs i isoton förhållanden visade, som visas i figur 4B, att efter tre på varandra följande BaCl2 stimuli, minskade frekvensen av exocytos händelser till 53% efter en andra stimulering och vidare ner till 26% av tredje stimulering jämfört med den första stimuleringen. Därför är det klart att på varandra följande Ba2 + stimuli inte verkar påverka antalet neurotransmittorer frigörs från varje vesikler när exocytos utlöses, men avsevärt påverkar effektiviteten i vesikler utgivningsprocessen.

För att undersöka hur sekretoriska vesikler i deras infödda miljö påverkas av extracellulära osmotisk stress vesikler volymmässigt eller kvantfysikaliska storlek, vesikler storlek analys med TEM imaging kombinerades med intracellulära elektrokemiska flödescytometri på celler utsatt för isoton och hyperton villkor. I de intracellulära elektrokemiska flödescytometri experiment infogades en kolfiber nanotip elektrod i cytoplasman i levande chromaffin celler när den placeras i isoton och hyperton lösning (som visas i figur 5.) Den resulterande amperometrisk nuvarande spiken övervakades av varje vesikler i cellens cytoplasma kollidera, absorberande, och stochastically spricker och släppa vesikler innehållet på ytan av amperometrisk elektroden vid spricker26. Integrerad totala laddningen upptäckts för varje topp i aktuellt kontra tid spår användes för att beräkna den genomsnittliga vesikler kvantfysikaliska storleken i varje cell inspelning av Faraday´s lag. Dessa intracellulär flödescytometri elektrokemiska mätningar visas i figur 6 och figur 7B, visat att vesikler kvantfysikaliska storlek på celler utsätts för osmotisk stress minskade betydligt jämfört med på celler i isoton villkor. Jämföra omfattningen av ändring i vesikler kvantfysikaliska storlek mätt med intracellulära elektrokemiska flödescytometri, till fraktionerad minskningen av mängden signalsubstans som frigörs vid exocytos vid celler upplever extracellulära osmotisk stress , visade en relativ minskning av 60% i både kvantfysikaliska storlek och mängden signalsubstansen släppt jämfört på celler i isoton villkor (figur 7)24. För att relatera justeringen i vesikler kvantfysikaliska storlek till en potentiell variation i vesikler neurotransmittorn koncentration av celler upplever osmotiska trycket, utfördes TEM bildanalys för att bestämma vesikler storleken på celler utsätts för isoton och hyperton villkor. Dessutom användes den mörk färgning av tät kärna protein matrix inuti LDCVs som visualiseras i TEM bilder som en mörk sfär i membranet bundna blåsor för att mäta volymen av tät kärna matrix i dessa blåsor. Som presenteras i figur 8, sänktes vesikler storlek till 60% på celler utsätts för extracellulära osmotisk stress jämfört med i celler i isoton villkor. Från den beräknade volymen uppmätta diametern på LDCV och den tät kärnan, volymen av den omgivande halo-lösningen som visas som en klar lösning inuti LDCVs i TEM bilder beräknades också. Summerade resultaten från TEM bildanalys visade, som visas i figur 8, att volymen av den halo lösning i LDCVs som är under extracellulära osmotiska chock är det främst minskade24.

Figure 1
Figur 1 : Enda cell exocytos amperometry. En schematisk bild av experimentella Ställ för amperometrisk mätning av exocytos vid enkel chromaffin celler24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: amperometrisk spår från exocytos mätningar.  (A) A representativa amperometrisk inspelning av exocytos vid chromaffin celler i isoton (svart färg) och i hyperton (röd färg) extracellulära miljöer. (B) utvidgningen av en genomsnittlig amperometrisk spike från exocytos mätning av chromaffin celler i isoton (svart) och hyperton (röd) extracellulära miljöer24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Reversibilitet av numrera av katekolaminer släppt på exocytos efter osmotiska chock. (A) antalet molekyler frigörs vid exocytos från chromaffin celler (n = 4) av tre på varandra följande Ba2 + stimuli, med den första stimuleringen i isoton, andra i hyperton, och tredje i isoton buffert. De statistiska resultaten av oparat t-test visas. P -värdet för jämförelse av första Ba2 + stimulering (Ba2 + stim 1) i isoton buffert med andra Ba2 + stimulering (Ba2 + stim 2) i hyperton buffert är p= 0.1088 och p-värde för jämförelse av den andra Ba2 + stimuleringen i hyperton lösning med tredje Ba2 + stimulering (Ba2 + stim 3) i isoton buffert är p = 0,059. (B) kontroll experiment visar mängden signalsubstans molekyler släpps vid tre på varandra följande Ba2 + stimuli av chromaffin celler (n = 4) i isoton buffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Effekten av osmotiskt tryck på exocytos aktivitet. (A) effekten av extracellulära osmolaritet på exocytos aktivitet presenteras som frekvensen av exocytos händelser när chromaffin celler (n = 4) stimuleras med barium lösning i isoton och hyperton, och slutligen i isoton villkor. Värdena presenteras som Genomsnittligt antal spikar från varje cell och genomsnittet från alla celler provtas (standardfelet för medelvärdet (SEM)). Den statistiska betydelsen av förändringar presenteras med hjälp av ett t-test för oparade data ( p -värdet för isoton Ba2 + stimulering 1 och hyperton Ba2 + stimulering 2 är p= 0,0126 och p-värde för jämförelse av hyperton Ba2 + stimulering 2 och isoton Ba2 + stimulering 3 är p= 0.037). (B) kontroll experiment presentera frekvensen av exocytos händelser efter tre på varandra följande barium stimuli på chromaffin celler (n = 4) i isoton villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Intracellulära vesikler elektrokemiska flödescytometri att övervaka förändringar i vesikler kvantfysikaliska storlek. (A) en schematisk bild av den experimentella ställa in används för intracellulära elektrokemiska flödescytometri. (B) en skanning elektronmikroskopi bild av en typisk nanotip koniska kolfiber elektrod24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Intracellulär flödescytometri elektrokemiska mätningar visar (A) representativa spår av intracellulära amperometrisk flödescytometri inspelningar på chromaffin celler i isoton (svart) och hyperton (röd) extracellulära miljöer. (B) utvidgningen av en genomsnittlig amperometrisk spike från intracellulär flödescytometri mätning vid chromaffin celler i isoton (svart) och hyperton (röd) extracellulära miljöer24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Kvantifiering av numrera av katekolaminer släppt på exocytos och bestämning av vesikler kvantfysikaliska storlek. (A) det genomsnittliga antalet molekyler frigörs vid exocytos inspelningar på chromaffin celler i isoton (n = 22) och hyperton (n = 20) miljöer. Värdena presenteras som ett genomsnittligt antal molekyler släppte per exocytos händelse från varje cell och i genomsnitt från cellerna provtas (± SEM). Den statistiska betydelsen av förändringar presenteras med t-test för oparade data (p -värde = 0.0003) (B) det genomsnittliga antalet molekyler per vesikler som upptäcks av intracellulära elektrokemiska flödescytometri vid chromaffin celler i isoton (n = 19) och hyperton (n = 16) villkor. Värdena presenteras som det genomsnittliga antalet molekyler per spike som upptäckts från varje cell och i genomsnitt från alla celler provtas (± SEM). Den statistiska betydelsen av förändringar presenteras med hjälp av t-test för oparade data (p - värde = 0.0108)24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : Effekt av osmotiska trycket på stora tät kärna ur vesiclen storlek. Den beräknade volymen av LDCVs, tät kärna proteinet och halo lösningen kring tät kärna protein matrix beräknades i attolitres (aL) från bildanalys av TEM bilder av chromaffin celler i isoton (n = 12) och hyperton (n = 9) buffertar. Resultaten har samlats in från ett genomsnitt av 311 blåsor per cell och medelvärden från enstaka celler (± SEM). P-värden rapporteras från oparat t-tester jämföra isoton och hyperton buffertar. P-värdet är 0.0385 (*) för vesikler volym, 0.3967 för tät kärna volym, 0.0047 (*) för halo volym24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll och fördelarna med att kombinera tre kompletterande analytiska metoder för att analysera sekretoriska vesikler och exocytos processen att få en bättre förståelse för hur en fysisk kraft såsom osmotiska trycket kan påverka sekretoriska vesikler och processen exocytos i sekretoriska celler. Dessa metoder inkluderar kolfiber mikroelektrod amperometry, som är en etablerad metod för inspelning exocytos aktivitet, intracellulära elektrokemiska flödescytometri, som används för att bestämma kvantfysikaliska storlek av blåsor i sin ursprungliga miljö, och överföring elektronmikroskopi bildanalys att övervaka sekretoriska vesikler volym. I detta arbete, genom att samla in kvantitativa uppgifter från amperometry inspelningar av enstaka vesikel exocytos händelser vid chromaffin celler utsätts för en isoton och hyperton extracellulära miljö, vi bekräftat att osmotiska chock avsevärt minskar den mängden signalsubstanser frigörs vid exocytos och att dessa celler reversibelt kan återhämta sig och släppa den ursprungliga kvantiteten, om läggs tillbaka i en isotonisk miljö (figur 3).

Amperometrisk inspelningarna upplysningar av frekvensen av exocytos händelser jämfört med tiden och kan därför också användas för att övervaka ändringar exocytos aktiviteten på celler i olika osmotiska miljöer. Dessa data kan tolkas och användas för att urskilja huruvida förändringar i aktivitet uppstå omedelbart eller som en funktion av tiden. Som vi visade i tidigare arbete, även om osmotisk stress hämmas exocytotic aktivitet, verkade det inte att hindra fusion av den lätt releasable poolen av blåsor24. Exocytos aktivitetsdata kan också användas för att analysera den totala exocytotic aktiviteten under en tid inspelning. Här presenterar vi det ackumulerade antalet exocytos händelser från en 3-minuters inspelning av exocytos vid chromaffin celler utsätts för två olika osmotiska villkoren. Dessa data visar en hämning i exocytos aktiviteten hos celler som upplever osmotisk stress och att en partiell återhämtning av denna aktivitet kan uppnås efter celler återvända till en extracellulär isoton miljö. Dock mycket viktigt, visade kontroll experimenten att flera Ba2 + stimuli inom den tidsram som används i dessa experiment orsakade en signifikant minskning i exocytos aktivitet av varje gång en cell stimulerades till sekretion. Endast en tredjedel av aktiviteten exocytos underhölls av tredje i rad Ba2 + stimulering, och tydligt barium, och kanske också tidpunkten för stimuli i dessa experiment, påverkar cykelns vesikler. Detta kan vara relevanta för att förklara varför exocytotic aktiviteten återfanns i celler placeras i isoton lösning efter den osmotiska chocken och varför dessa celler visas en likartad relativ minskning i aktivitet jämfört med celler i isoton villkor efter tre sekventiell Ba2 + stimuli. Därför ger amperometry inspelning av exocytos information om sekretoriska vesikler från det ögonblick blåsor utlöses för att sammansmälta med plasmamembranet, frigöra signalsubstanser genom fusion pore. Därmed kvantitativa uppgifter om enstaka vesikel signalsubstansen släpp och information om aktiviteten exocytos kan samlas.

Mängden signalsubstans släppt kan regleras av funktionsläget av exocytos som utlöses, där antingen full vesikler innehållet eller del av innehållet släpps. Genom att enbart studera exocytos release använder kolfiber amperometry som endast upptäcker vad utvisas från en vesikel, är det svårt att urskilja om en förändring i den upptäckta mängden signalsubstans släppt är relaterad till en förändring i utlöst läge exocytos, en förändring i de cellulära biofysiska egenskaper som påverkar vesikler innehåll release eller förändringar i vesikler kvantfysikaliska storlek. Därför, genom att komplettera amperometrisk inspelningen av exocytos med mätningar med den intracellulära elektrokemiska flödescytometri, i situ mätningar av vesikler kvantfysikaliska storlek på levande celler kan kännetecknas och därmed används för att jämföra den bråkdel av vesikler innehåll release från blåsor under exocytos26.

I detta arbete, för att undersöka om vesikler kvantfysikaliska storlek påverkades av osmotisk stress, tillämpat vi denna teknik för kvantifiering och utvärdering av vesikler kvantfysikaliska storlek på celler utsätts för isoton och hyperton villkor. Som införandet av nanotip elektroden i cytoplasman i en levande cell anses ganska invasiv, dessa experiment utfördes endast en gång per cell och upprepades inte på samma cell. Därför utförs dessa experiment företrädesvis som individuella mätningar från grupper av slumpmässigt valda celler utsätts för en isoton och hyperton extracellulära miljö. För att jämföra ändringar i vesikler kvantfysikaliska storlek mätt med intracellulära elektrokemiska flödescytometri till förändringar i belopp signalsubstansen släppt på exocytos, bör man överväga matchar experimentella villkoren av intracellulära inspelning och också utföra amperometry inspelning av exocytos vid olika slumpmässiga celler. Om studier utförs på samma enda cell, är det viktigt i dessa experimentella protokoll också överväga påverkan av på varandra följande BaCl2 stimuli, och se till de experimentella villkor matchar de som används för intracellulär flödescytometri mätningar. Det är också värt att notera att det är svårt att kontrollera exakt placering och djup av elektroden när sätts in i en cell. Varje cell ger således ett stickprov för vesikler kvantfysikaliska storlek analys. Dessutom sondera vesikler kvantfysikaliska storlek med den här metoden skiljer inte skillnader i, exempelvis vesikler mognad och därför också kan lägga till variation i mätningar. Intracellulära experiment visade att vesikler kvantfysikaliska storlek minskade på celler utsätts för extracellulära osmotiska trycket. Den relativa minskningen kvantfysikaliska storlek upptäcks av denna metod jämfördes med observationer av relativa förändringar i neurotransmitterfrigöraren under exocytos. Denna studie fann att den relativa minskningen av kvantfysikaliska storlek på samma ordning som minskningen av neurotransmitterfrigöraren på celler avkänning osmotisk stress.

Kontrollera om osmotisk stress var att förändra vesikler neurotransmittorn koncentration, vesikler volymen utvärderades med TEM imaging analys för kemiskt fast chromaffin celler som hade exponerats för isoton och hyperton villkor. TEM imaging analys visade att blåsor krympa när celler utsätts för en osmotiska chock och att den relativa minskningen storlek justeras tillsammans med vesikler kvantfysikaliska storlek att upprätthålla en konstant neurotransmittorn koncentration24. TEM bildanalys, vilket ger nanometer bildupplösning kan skilja de två faserna, matrisen protein tät kärna och omgivande halo lösningen inuti LDCVs, och således gör det möjligt att bestämma volymen av tät kärna protein matrix och beräkna volymen av halo lösningen. Från denna analys bestämdes nedgången i vesikler volym främst relateras till en minskande volym från halo lösningen kring den tät kärna protein matrix24.

Sammanfattningsvis, denna studie presenterar ett protokoll som visar hur tre analytiska metoder kombineras, och tillåter karakterisering av sekretoriska vesikler innan signalsubstansen release och vad frigörs från dessa blåsor när celler utlöses till exocytos, att få en bättre förståelse för hur sekretoriska vesikler och cell funktioner som exocytos påverkas av extracellulära stress. Detta protokoll kan också användas för att besvara frågor på hur signalsubstansen frigivning vid exocytos och vesikler kvantfysikaliska storlek påverkas av andra förändringar i den fysiska miljön eller av potentiella läkemedel som kan påverka sekretoriska celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Vetenskapsrådet (349-2007-8680) för finansiering och Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Sverige) för donation av nötkreatur binjurarna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma Aldrich S7653
KCl Sigma Aldrich P9333
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
MgCl2 Sigma Aldrich M-2670
Glucose Sigma Aldrich G8270
Collagenase P Roche, Sweden 11 213 857 001
100-µM Nylon mesh Fisher Sientific 08-771-19
Percoll Sigma Aldrich P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish VWR 354416
Centrifuge Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller Narishing Inc., Japan PE-21
Epoxy solutions (A and B) Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller Narishing Inc. EG-400
Inverted Microscope Olympus IX81
Patch clamp Instrument Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200B
Micromanipulator Burleigh Instrument Inc., USA PCS-5000
Butane Flame Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy Omega Leo 912 AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

Tags

Neurovetenskap fråga 132 Chromaffin celler osmotiska trycket tät kärna blåsor neurotransmittorn koncentration kvantfysikaliska storlek exocytos amperometry intracellulär flödescytometri transmissionselektronmikroskopi
Övervaka effekten av osmotisk Stress på sekretoriska vesikler och exocytos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi,… More

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. S. Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis. J. Vis. Exp. (132), e56537, doi:10.3791/56537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter